梨火疫病菌两个Sec依赖的外泌纤维素酶鉴定及在侵染梨幼果过程中的基因表达分析

严海璘,朱宗财,张王斌,杜培秀,张超,赵文军,李为民*

1.塔里木大学植物科学学院，新疆 阿拉尔 843300; 2.塔里木大学，南疆农业有害生物综合治理重点实验室，新疆 阿拉尔 843300; 3.中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081; 4.中国检验检疫科学研究院，北京 100176

梨火疫病(fire blight)是一种毁灭性的植物病害，主要危害仁果类果树和蔷薇科植物。该病害自19世纪末首次发现于美国，现已蔓延至欧洲、北非、大洋洲和亚洲等50多个国家，严重威胁全球苹果和梨产业的发展[1-2]。梨火疫病的病原为梨火疫病菌(Erwiniaamylovora)，是一种革兰氏阴性细菌，隶属于肠杆菌科欧文氏菌属。因其危害严重，梨火疫病菌名列全球十大植物病原细菌之一[3]，在许多国家和地区被列为重要的检疫性病原[4]。梨火疫病菌一般通过自然孔口和伤口作为感染途径，首先侵入树木皮层薄壁组织的细胞间隙，在后期进入木质部导管，并能在植物体内快速迁移；感病植株最初症状表现为水浸状，随后出现萎蔫和坏死，受感染的部位变成棕色或黑色，类似火烧一样，最终导致整棵树的死亡[5-6]。

病原菌分泌的致病相关蛋白也称为效应因子，在与宿主植物互作过程中发挥重要作用[7-8]。在革兰氏阴性菌中，III型分泌系统、IV型分泌系统、Sec依赖分泌途径和双精氨酸移位酶途径(Tat途径)是效应因子输出的主要通道[9]。其中，Sec分泌途径包括由3种跨膜蛋白SecY、SecE和SecG组装的SecYEG通道，在外周膜ATP酶SecA的协助下转运包括毒力因子在内的各种蛋白；此外，Sec途径还包含SecD、SecF和YajC，由这3种膜蛋白参与调控蛋白质的高效输出[10-11]。Sec分泌蛋白在细胞质中以未折叠前蛋白的形式存在，氨基末端为信号肽(signal peptide, SP)，指导前体蛋白经由Sec系统转运。在革兰氏阴性菌中，前体蛋白跨越细胞内膜，转移至周质，由胞外信号肽酶I(LepB)或脂蛋白信号肽酶II(LspA)切割SP，并折叠为成熟蛋白；成熟蛋白或者停留在周质中，或者转移到次级分泌途径，如V型分泌系统(type V secretion system,T5SS)、脂蛋白(Lol)途径或Ⅱ型分泌系统(typeⅡsecretion system,T2SS)，并进一步转运为外膜或胞外蛋白[7-8,11]。

植物病原菌分泌的细胞壁降解酶是一类重要的致病因子[12-14]。细胞壁降解酶包括纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、木聚糖酶等，在病原菌消解植物抗侵染机械屏障、入侵寄主等方面发挥着重要作用。纤维素酶是与致病相关的主要酶类之一[15-18]，已知许多黄单胞菌属(Xanthomonas)、欧文氏菌属、青枯菌属(Ralstonia)的植物病原细菌，以及丝核菌属(Rhizoctonia)、稻瘟菌属(Magnaporthe)的植物病原真菌均分泌纤维素酶[19-22]，以此协助病原自身的入侵与扩散。

迄今为止，关于梨火疫病菌是否编码具有分泌特征的纤维素酶类尚不清楚。本研究利用生物信息学技术结合大肠杆菌(Escherichiacoli)碱性磷酸酯酶(phosphatase, PhoA)检测体系，从梨火疫病菌全基因组序列中筛选出2种依赖Sec途径分泌的纤维素酶EAMY_3602(GenBank：FN434113.1)和EAMY_1236(GenBank：FN434113.1)，并对其进行反转录实时荧光定量PCR(reverse transcription quantitative real-time PCR, RT-qPCR)分析，以期发现梨火疫病菌的毒力因子，为梨火疫病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

梨火疫菌株DSM17948由中国检验检疫科学研究院保存，pET-30a质粒、大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)均由本实验室保存。试验所用试剂盒均购自TaRaKa、TIANGEN、全式金公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1生物信息学分析 分泌蛋白信号肽的生物信息学分析基于SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)[23]、Lipopversion 1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/LipoP/)[24]和Phobius(http://phobius.sbc.su.se/)[25]完成；Sec依赖分泌蛋白中纤维素酶的筛选参照梨火疫病菌CFBP1430编码蛋白的功能注释[26]。

1.2.2基因克隆 根据梨火疫病菌CFBP1430 (GenBank：FN434113.1)、EAMY_3602和EAMY_1236编码基因(分别命名为Ea3602和Ea1236)的核酸序列，设计两对引物3602-F/3602-R和1236-F/1236-R(引物序列见表1)。利用CTAB法提取梨火疫菌株DSM 17948的基因组DNA，以此为模板，利用上述引物分别扩增Ea3602和Ea1236，PCR扩增、产物回收、连接、转化均参照严海璘等[27]的方法进行。

1.2.3PhoA检测 基于大肠杆菌的PhoA检测体系由本研究室构建[28]。设计两对引物3602SP-F/3602SP-R和1236SP-F/1236SP-R(引物序列见表1)，分别以pMD-Ea3602和pMD-Ea1236质粒为模板，PCR扩增Ea3602和Ea1236基因的信号肽编码序列，长度分别为42和60 bp，mphoA载体构建和检测均参照严海璘等[27]的方法进行。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primers used in this study

1.2.4接种梨幼果 梨幼果接种参照严海璘等[27]的方法进行。接种后分别在0、8、24 h取样，用无菌刀片刮取大约0.8 g的剖面组织，于-80℃冰箱中保存备用。

1.2.5总RNA提取与RT-qPCR分析 提取样品总RNA，反转录获得cDNA。以梨火疫菌recA(GenBank: FN434113.1)为内参基因[29]，利用引物3602-qF/3602-qR、1236-qF/1236-qR(引物序列见表1)分别进行Ea3602和Ea1236基因表达的qPCR分析。具体参照TB Green©Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)说明书进行。数据分析采用2-ΔΔCT(Livak)方法计算相对表达量，ΔΔCT=(CT目的基因-CT内参基因)试验组-(CT目的基因-CT内参基因)对照组，显著性差异分析采用Student’st-test[30]，P<0.05和P<0.01表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 筛选梨火疫病菌Sec依赖分泌纤维素酶

前期研究表明，梨火疫病菌CFBP1430编码3 393个蛋白，其中168个蛋白N末端为SPs，推测其可能通过Sec系统分泌[31]。参照CFBP1430编码蛋白的功能注释[26]，我们从168种Sec依赖分泌蛋白中进一步筛选出2种具有纤维素酶功能的蛋白：EAMY_3602和EAMY_1236，其中前者为内切葡聚糖酶，后者为β-葡萄糖苷酶。目前，已有CFBP1430[26]、ATCC49946[32]和E-2[33]共3个梨火疫病菌菌株完成了全基因组序列测定。Blast分析表明EAMY_3602和EAMY_1236在所有3个菌株中的同源性均为100%。利用SignalP 4.1、Lipopversion 1.0和Phobius分析进一步证实EAMY_3602和EAMY_1236 N末端为信号肽序列，且均由信号肽酶LepB切割，切割位点分别位于第14个和20个氨基酸(表2)。

2.2 克隆Ea3602和Ea1236基因

以梨火疫菌株DSM17948的基因组DNA为模板，利用3602-F/3602-R和1236-F/1236-R扩增EAMY_3602和EAMY_1236的编码基因，分别获得975和2 298 bp的PCR产物(图1)，与预期结果大小一致。将目的片段回收、连接，测序结果确证所扩增片段为Ea3602和Ea1236。

2.3 验证EAMY_3602和EAMY_1236的分泌特性

为了验证EAMY_3602和EAMY_1236的分泌特性，我们分别将EAMY_3602和EAMY_1236信号肽(3602SP和1236SP)的编码序列插入pET-mphoA，与mphoA融合，构建pET-3602SP-mphoA和pET-1236SP-mphoA(图2A)，转化至大肠杆菌BL21细胞。PhoA检测结果显示：含有pET-3602SP-mphoA或pET-1236SP-mphoA转化子在指示培养基培养6 h后，呈现蓝色，与阳性对照(含有pET-phoA的BL21细胞)结果相似，而阴性对照(带有pET-mphoA的BL21细胞)仍保持白色(图2B)。这一结果表明3602SP和1236SP能够引导mphoA从细胞质转移到周质，由此证实EAMY_3602和EAMY_1236可通过梨火疫病菌的Sec途径进行分泌。

表2 梨火疫病菌Sec依赖分泌纤维素酶Table 2 The putative Sec-dependent secreted cellulase identified from E. amylovora

M—DL 5 000 Marker; 1—Ea3602 的PCR产物；2—Ea1236的PCR产物图1 Ea3602和Ea1236基因的PCR扩增Fig.1 PCR product of Ea3602 and Ea1236 gene

2.4 Ea3602和Ea1236在梨火疫病菌侵染幼梨过程中的表达分析

为了揭示Ea3602和Ea1236在病原菌侵染过程中的潜在功能，我们用梨火疫病菌接种酥梨幼果，分别在接种后0、8、24 h提取总RNA，利用RT-qPCR分析这两种纤维素酶编码基因的表达水平。结果显示：Ea3602在8和24 h的表达量逐渐降低，但与0 h相比无显著差异(图3)；相反，Ea1236在8和24 h的表达量逐步提高，分别较0 h提高2.43和3.26倍，差异具有统计学意义(P<0.01)。由此推测β-葡萄糖苷酶EAMY_1236可能是梨火疫病菌的毒力因子，在侵染寄主植物过程中发挥重要作用，而内切葡聚糖酶EAMY_3602则与梨火疫病菌侵染无明显关联。

A：PhoA检测体系的载体示意图；B：信号肽3602SP和1236SP引导mphoA分泌图2 利用phoA体系检测EAMY_3602和EAMY_1236的信号肽Fig.2 The signal peptides of EAMY_3602 and EAMY_1236 were detected by phoA system

注：**—与同组0 h相比，差异有统计学意义(P<0.01)。图3 Ea3602和Ea1236基因在梨火疫病菌侵染过程中的表达分析Fig.3 Analysis on the expression of Ea3602 gene and Ea1236 gene in the process of infection of E. amylovora

3 讨论

在细菌中，大约20%～30%的编码蛋白定位于胞质外，蛋白的胞质外转运对于维持细菌生存至关重要[9,34]。Sec分泌途径在细菌中广泛存在，是蛋白胞质外转运主要的跨膜运输系统[35]，包括毒力因子在内的很多蛋白均通过Sec途径分泌到胞质外环境中[10-11]。关于梨火疫病的研究已有百余年历史，目前已明确胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)能够保护梨火疫病菌有效躲避植物防御系统，以及在干旱条件下免受水分和营养损失[36-38]；此外发现DspA/E、HrpN、Eop1和AvrRpt2EA等III型分泌系统(Type III secretion system, T3SS)分泌蛋白对于病原菌入侵及其在寄主植物中定殖同样具有重要作用[39-41]。最新研究显示,梨火疫病菌可能利用Sec途径分泌蛋白酶介导病原侵染[31]。本研究利用生物信息学分析结合PhoA检测体系，从梨火疫病菌Sec分泌蛋白中筛选鉴定出2个纤维素酶：EAMY_3602和EAMY_1236。已有研究表明许多植物病原细菌和病原真菌分泌的纤维素酶是其完全毒力发挥所必需的[19-21]；同时，纤维素酶也是激发植物防御反应的有效诱导物，例如，用纤维素酶处理甜椒叶片，能够诱导水杨酸水平显著增加[42]。

纤维素酶根据结构、功能和作用方式，可分为外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶[43-44]。参照梨火疫病菌编码蛋白的功能注释[26]，本研究筛选的两个纤维素酶EAMY_3602和EAMY_1236分别为内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。关于病原菌内切葡聚糖酶已有大量研究，如：水稻黄单胞菌(X.oryzaepv.oryzae)、菊欧文氏菌(E.chrysanthemi)、柑橘黄单胞菌亚种(X.citrisubsp.citri)的内切葡聚糖酶均为其重要毒力因子，参与病原菌的致病过程[21,45-46]。但是，本研究发现梨火疫病菌在侵染幼梨时，Ea3602的mRNA表达量没有显著变化，因而推测Sec分泌内切葡聚糖酶EAMY_3602可能与梨火疫病菌侵染无密切关联。与之相反，Ea1236基因在病原侵染过程中mRNA表达量显著提高，暗示β-葡萄糖苷酶EAMY_1236可能是梨火疫病菌潜在的毒力因子。但根据早期报道，梨火疫病菌在致病过程中没有造成寄主植物细胞壁多糖的降解[47]，暗示纤维素酶没有参与该病原对寄主的侵染；此外，另有文献指出在梨火疫病菌中表达大肠杆菌β-葡萄糖苷酶，对其毒力没有显著影响[48]。因此，我们在后续研究中将制备Ea1236基因的敲除突变体，确证EAMY_1236是否参与病原侵染以及在不同时空维度的作用，以期揭示梨火疫病菌致病的新机制。