早期介入高压氧提高寒冷应激下小鼠存活率并促进创面愈合的研究

王丽敏,刘诗博,郭大志,潘树义,王振,郭博远,王惠,张旭娟,赵鹏翔*,谢飞,马雪梅

1.北京工业大学生命科学与生物工程学院, 北京 100124; 2.中国人民解放军总医院第六医学中心, 北京 100048

寒冷应激对人类，尤其是对幼儿、老年人和具有潜在疾病人群的健康危害严重。尽管人体可以通过自身的调节来维持体内稳态预防伤害，如通过减少热损失和增加产热机制等[1]，但长时间暴露在寒冷环境下仍然会威胁人的生命安全。从生理学上讲，寒冷环境的刺激会对人体多种组织器官产生影响，包括对呼吸系统[2]、血液循环系统[3]和心血管系统[4]等的影响。

伤口愈合是急性皮肤损伤后的一个重要生理过程，分为四个不同但又重叠的阶段: 止血、炎症、增生[5]、重塑[6]。和常温条件下相比，大面积的创伤暴露在寒冷环境下的危险性更高。已有研究表明，HBO治疗可用于组织低氧症和癌症等疾病[7-8],也可以用于伤口的愈合[9],临床上对急性伤口的处理中，HBO治疗的氧压力通常设置为2～2.5个绝对大气压(ATA)，治疗时间一般为1.5～2 h[7,10]，氧气浓度为85%～95%。一些临床试验将自损伤起的一周后定义为早期干预，将自损伤起的3周后定义为晚期干预，在这两个时间点进行干预发现，HBO治疗可以有效改善伤口部位的血流、供氧等情况[10]。而创后更早时间的干预可能会使活性氧(reactive oxygen species, ROS)产生过多，导致氧化应激，从而在许多方面造成生理上的损害[11-12]，比如DNA突变[13]。

目前，HBO治疗的机理尚未阐明，但已有研究提出了相关理论。HBO治疗可能帮助恢复创面组织的氧水平，使得其作为电子传递链最后一步的氧促进附近细胞线粒体内ROS的生成，从而防止代谢功能障碍的细胞发生凋亡[14]；HBO治疗还可以增加伤口上方的含氧量[15]，随即提高全身ROS水平使其发挥创伤愈合通路第二信使的功能[11]；还可通过降低肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)和白细胞介素-8(interleukin-8, IL-8)的表达来表现出抗炎功能[16],另外它在激活炎性小体信号功能方面也有很好的作用效果。所有这些发现都表明，HBO治疗在一些临床应用方面可能是一把双刃剑。

为了提高皮肤大面积创伤患者在低温条件下的存活率，我们尝试了不同HBO治疗介入时间策略。本研究建立了c57小鼠背部皮肤全层缺损模型，提出了利用HBO治疗急性创面的新干预策略。通过比较皮肤损伤后0、24、48 h分别介入HBO的治疗效果，我们发现最早实行高压氧干预治疗组(0-hHBO组)的存活率更高且伤口愈合速度更快，考虑到大多数临床试验均是对受伤后一周HBO治疗的患者进行的调查，本研究结果可能会带来新的思路，即在寒冷的条件下，越早进行HBO治疗可能会给受伤患者带来越好的预后效果。

1 材料与方法

1.1 实验材料

所有动物的研究都遵循中国科学院第六医学中心生物医学研究伦理委员会所认可的章程，且实施的所有步骤程序均与中国实验动物管理条例规定一致。实验动物为购自中国北京维通利华动物科技有限公司的6周龄C57BL/6J健康小鼠，体重为20～24 g。在手术之前，小鼠需在手术室适应环境3 d，手术室温度为26 ℃，光照条件为12 h光照/12 h黑暗。另外，所有小鼠均可自由饮食。

抗体名称及编号：兔抗NF-kB,编号ab16502,Abcam公司生产；兔抗Bcl-2 抗体,编号ab182858,Abcam公司生产；兔抗p-p38抗体, 编号ab4822,Abcam公司生产。免疫组化相关试剂购自北京中衫金桥公司。

1.2 全层皮肤创伤模型

用灭菌的圆形打孔器在每只小鼠后背的皮肤上描画1个1.2 cm直径的圆形，然后用镊子夹起圆形轮廓中央的部分，用剪子制造出一个不深过肌肉层的开放性伤口，然后利用尼龙线固定创伤上方的1.5 cm直径的透明硅胶环，防止小鼠通过皮肤皱缩来加速伤口愈合，由此制造出一个全层皮肤缺损创伤模型。

1.3 利用82%浓度HBO在1.5 ATA条件下的1 h呼氧治疗

给小鼠实施压力为1.5个大气压，氧气浓度为82%，稳压治疗时间为1 h的治疗方法。具体操作为：将小鼠放入HBO盒子之后，在15 min内将压力加至1.5个大气压，让氧压保持在该水平1 h整，之后在15 min内降压至最初，最后将小鼠拿出氧气盒子。

1.4 寒冷环境条件

在自饲养至处死小鼠的整个实验过程中，温度被严格控制在4～6 ℃的范围，而且维持手术室的湿度在10%～15%的范围内。

1.5 免疫组化(immunochemistry, IHC)

应用石蜡切片，片子的制作在公司完成。将切片置于70 ℃烤片机中，拷片30 min；将烤过后的切片迅速放入二甲苯中，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各放置 10 min，而后迅速放入100%、90%、80%、70% 的乙醇中各5 min，之后蒸馏水中放1 min；利用3%过氧化氢溶液去除内源性过氧化物酶；组织上滴加新鲜配制的3% H2O2，室温避光10 min，之后放入纯水1 min；将切片浸入0.01 mol·L-1枸橼酸缓冲液，微波中大火力(80%)加热3 min，中火力(40%)加热8 min，冷却至室温；使用山羊血清封闭组织，37 ℃孵育30 min；适当稀释抗体，4 ℃过夜孵育；利用PBS清洗一抗3次后滴加二抗，室温条件下孵育2 h，使其充分与组织表面的抗体接触，然后清洗；滴加1∶20稀释的DAB工作液于组织上，显色10 s，在显微镜下观察显色程度，蒸馏水冲洗后利用苏木素染色3～5 min，然后用流水冲洗掉染液；1%盐酸酒精分化1～3 s，水洗，置于自来水中浸泡返蓝5～10 min；浸入80%、90%、95%和100%乙醇及两缸二甲苯中进行脱水、透明,滴加1滴中性树胶于组织上，盖玻片封片。24 h后置于显微镜下观察拍照。

1.6 测量创伤面积

在完成动物模型之后立即拍摄第1组图片，之后每天在同一时间以相同的焦距拍摄小鼠的皮肤创伤。拍照之后利用软件Image J来自动计算创伤面积，该软件以每张图片中的纸质标尺为参照，并估算出每张图片中创伤的面积。

1.7 数据分析

本实验所有数据资料均采用统计软件GraphPad Prism 8版本进行数据分析，在符合正态性和方差齐性的前提下，以均数±标准差(M±S)进行统计学描述；统计推断则采用t检验(t-test)。所有的实验均重复2次。

2 结果与分析

2.1 高压氧的早期干预对寒冷条件下皮肤创伤小鼠生存率的影响

不同的HBO干预策略对小鼠存活率影响较大。HBO组与Control组的比较表明，前者提高了创伤小鼠的生存机会。HBO各组之间的比较显示，越早进行HBO干预，存活率越高(表1)。第3天时0-hHBO组都存活,24-hHBO、48-hHBO组小鼠各自出现了38%、22%的死亡，而对照组(表1)小鼠出现高达63%的死亡。此外,在第4天,对照组中所有的小鼠全部死亡，而HBO组的小鼠44%～67%仍然存活(表1)。5 d后, HBO组没有进一步出现死鼠,第11天计算的最终死亡率中，0-hHBO是33%，24-hHBO 是50%，48-hHBO 是67%，对照组是100%。以上这些结果表明，HBO治疗的早期干预，特别是在受伤后立即介入治疗的策略，可以有效地减少受伤和寒冷环境所引发的死亡。

表1 小鼠在创伤后的不同时间介入HBO治疗的死亡率Table 1 Mortality of mice by intervening HBO at different points post wounding

2.2 HBO治疗及介入时间与创面愈合效果的关系

在伤口愈合过程中，从第一天开始，每两天拍照一次并检查伤口愈合情况。由于对照组小鼠第4天时死亡率达到100%(图1A)，因此该组在第5天及之后无法收集到任何数据。如图可以看出0-hHBO组伤口愈合速度始终是所有组中最快的，其他两组的愈合率稍落后。从第5天开始，HBO治疗组差异开始具有统计学意义(图1B)，揭示了依赖于介入时间的HBO治疗新方法，即0-hHBO 和24-hHBO治疗创面的愈合速率均优于48-hHBO。因此，本研究认为在受伤后立即进行HBO干预是促进伤口愈合的最佳策略。

2.3 寒冷条件下0-hHBO治疗对愈合相关血液指标的影响

上述研究已发现0-h HBO组在寒冷条件下的生存和伤口愈合效果最好，因此进行了更深一步的验证，我们观察了造模后第24 h时的血细胞计数以及血液的相关指标，以确定0-hHBO治疗后全身的变化。

白细胞 (WBC)数目的降低通常是低度炎症或病毒、细菌感染的标志[17]。本研究中，0-h HBO组和对照组的WBC计数均低于正常值，说明免疫功能不佳(图2A)，但前者的WBC计数明显高于后者(图2A)，提示HBO治疗早期干预可能会帮助恢复免疫应答；如图2B所示，0-hHBO组的红细胞密度大于对照组(P=0.022)，且两组的数值均在参考范围内(7.5～12.5)，说明0-hHBO治疗的小鼠发生贫血的可能性较小；0-hHBO组和对照组的血小板压积出现统计学差异(P=0.009)，但两组均在参考范围内(0.1～0.3)(图2C)，这与平均血小板体积(mean platelet volume, MPV)的检验一致(图2F)，这可能与血小板在止血阶段的消耗有关；两组间的粒细胞(granulocyte, GR)和淋巴细胞(lymphocyte, LY)百分比接近，但0-hHBO组单核细胞(monocyte, MO)较少，这可能是由于在伤口部位的单核细胞转变成了巨噬细胞所致，此外，两组之间的红细胞分布宽度(red blood cell distribution width, RDW)和红细胞平均血红蛋白浓度(mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC)存在明显差异。以上数据分析表明，0-hHBO治疗效果要优于前24 h完全不进行HBO干预的治疗方案。

A：各组小鼠在第0～11天的创伤拍摄图；B：利用Image J软件计算的创伤愈合率，愈合率=(第0天的面积-第n天的面积)/第0天的面积×100%。*，**，***，****分别表示同一时间不同处理间数据在P<0.05、P<0.01、P<0.001和P<0.000 1水平上有统计学意义。图1 不同时间点介入高压氧对创面愈合速率的影响Fig.1 The effect of healing rate by intervening HBO at different points post wounding

A～D：分别表示白细胞计数(WBC)、表示红细胞计数(RBC)、表示血小板压积(PCT)、表示不同种类白细胞(包括粒细胞、淋巴细胞和单核细胞)的比例；E：表示血细胞比容(HCT)、红细胞平均体积(MCV)和红细胞分布宽度(RDW)；F：表示血小板计数(PLT)、血小板分布宽度(PDW)和平均血小板体积(MPV)；G：表示血红蛋白(HGB)、平均红细胞血红蛋白数(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)。* —P<0.05, ** —P<0.01, *** —P<0.001, **** —P<0.000 1。图2 不同时间点介入高压氧对血细胞的影响Fig.2 The effect of blood cells by intervening HBO at different points post wounding

2.4 0-hHBO 与p38→NF-κB→Bcl-2分子路线的调控及对表皮干细胞等细胞中抗凋亡作用的激活

基于以上研究结果,存活率和伤口愈合速度都具有HBO 介入时间的依赖性,且创后立即早期干预具有最好的疗效，因此猜想可能在前24 h内小鼠的生理上发生了一些重要的变化,该时间段包括愈合过程中的炎症阶段。表皮细胞和毛囊细胞是表皮干细胞最丰富的两个部位，它可以加速愈合速度和组织修复，因此在伤口边缘的表皮和毛囊处进行了免疫组织化学(IHC)试验以检测炎症和凋亡情况。

如图3A和C所示, 0-hHBO治疗24 h后,NF-κB和bcl-2在伤口处的表达升高,且强阳性细胞主要位于表皮(黑色箭头)和毛囊(红色箭头)，细胞核也可见一些较深的染色;NF-κB上游信号因子之一的p-p38[18-19]。虽然在两个组的表达都不高,但0-hHBO组在表皮和毛囊处都显示出了弱阳性。因此, p38→NF-κB→Bcl-2信号通路应该是在HBO干预后被激活,并可能由此减少了表皮干细胞的凋亡率。

A～C：从左至右分别是物镜10倍和20倍放大，黑色箭头代表上皮区域，红色箭头代表毛囊;D：3个检验指标的图解通路，其中实线表示本研究已验证的生物学过程，虚线表示待证实过程。图3 IHC检测对照组和0-hHBO的NF-kb、p-p38和Bcl-2的表达Fig.3 HE staining of two groups (0-hHBO and control) about the expressing of NF-kb,p-p38 and Bcl-2

3 讨论

HBO干预是临床和实验研究中最重要的课题之一[20-21]。以往的大多数HBO的研究都集中在创伤性脑损伤(traumatic brain injuries, TBIs)，以HBO不同的介入时间为区别的治疗策略在治疗急性和慢性创伤性脑损伤时的疗效是不同的，Yang等[20]在3个不同的时间点(早期、延迟、早期联合延迟治疗)的治疗中发现，联合治疗效果最好，而较大面积的伤口，尤其是处在寒冷的环境中，对人类构成了很大的威胁。本研究中，通过比较受伤后0、24和48 h介入HBO，发现创后立即进行HBO治疗，然后每天继续治疗，直到愈合周期结束，能够显著提高小鼠的生存率和愈合速度。因此，针对寒冷条件下严重开放性伤口的治疗，我们提出了一种新的策略，即无论是急性期还是恢复期，高压氧的早期介入治疗都是最佳选择。

在寒冷环境中，影响受伤人员存活率的因素很多，如感染、循环系统疾病、体温、血氧浓度、营养等。本研究中，在11 d内没有观察到感染，存活率的提高可能与HBO治疗有关。全身血常规检测反映了创后立即进行HBO干预的24 h后，各组小鼠的整体情况均有改善,此外表皮干细胞(ESCs)被激活并从不同的皮肤区域募集至伤口处[22]，来帮助组织修复和伤口愈合，这也可能是提高存活率的一个关键因素。

冷应激(5℃左右)通常会引起细胞凋亡[23-25]，而对愈合过程至关重要的ESCs也可能遭受这种情况。通过IHC检测,我们发现0-hHBO治疗使得p38→NF-κB→Bcl-2通路被激活且显示出了抗凋亡作用，特别是在ESCs丰富的地方(表皮和毛囊)，我们初步推断HBO治疗可能保留了ESCs的活性。

NF-κB的激活也可能引起下游炎症信号的级联反应,并延迟伤口的愈合，本研究中，我们在动物实验中使用的HBO剂量并没有引发明显的炎症。我们推断，HBO治疗可能是一把双刃剑，需要更精准的生物学研究来确定冷应激下受伤患者的干预时间和剂量，提出更佳的治疗策略。

综上所述，本研究提出了HBO干预时机的新策略，即创伤后立即HBO治疗可以最大限度地提高冷应激损伤小鼠的存活率和愈合速率，对处在寒冷环境下创伤病人的治疗提供了重要的启示。