新城疫疫苗研究进展

姚舜禹,张丽琳

天津大学生命科学学院，天津 300110

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的急性、发热性、高度接触性禽类传染病，感染了新城疫的病禽的症状主要反映在消化系统和呼吸系统，常见于雏鸡[1-2]。ND于1926年、1927年在印度尼西亚爪哇岛和英国纽卡斯尔被相继发现，随后在韩国、印度、斯里兰卡、日本、澳大利亚和菲律宾都发现了新城疫疫情[3-5]。目前，全世界已有4次大规模的新城疫疫情爆发[6]。而且，不只是家禽(如鸡)，其他的鸟类(如鸽子、鹦鹉、野鸡、孔雀、野生水鸟等)也易感染NDV，迄今为止，已有超过236种鸟类被报道感染了NDV[7]。世界银行为了绘制《世界牲畜疾病地图册》，查阅了从2006年至2009年这4年里世界动物卫生组织对176个国家所做的《动物健康年鉴》，得出的结论是：新城疫是家禽中第四大问题性疾病，仅次于高致病性禽流感、禽传染性支气管炎和低致病性流感[8]。我国在《国家中长期动物疫病防治规划》中也将新城疫规定为优先防治和重点防范的五大动物疫病之一[9]。

NDV的核酸是单股负链RNA，从世界各地分离出来的NDV毒株有3种不同的碱基数：于1960年以前分离的基因组含有15 186个核苷酸[10]；在我国发现的毒株含有15 192个核苷酸[11]；在德国发现的弱毒株有15 198个核苷酸[12]。典型的NDV基因组包括3’端的55 nt先导序列和5’端的114 nt末端序列，除此之外还有6个新城疫病毒的必需基因，负责编码6个结构蛋白，分别是核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，N)、基质蛋白(matrix protein，M)、磷蛋白(phosphoprotein，P)、融合蛋白(fusion protein，F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(hemagglutinin-neuraminidase protein，HN)和大聚合酶链反应蛋白(RNA-dependent DNA polymerase，L)，顺序为3’-N-P-M-F-HN-L-5’[13]。其中，F蛋白和HN蛋白是引发融合过程的关键，并与NDV免疫原性密切相关[14]。NDV作为一种RNA病毒，变异性较大，一直在不断发展产生新的亚型。根据F蛋白基因编码序列的差异，以及Czeglédi等[15]对NDV基因组的分析，同时参考了病毒分类系统标准，将NDV分为2大类，其中仅有1种基因型被归类于为Ⅰ类(ClassⅠ)，而另外18种基因型为Ⅱ类(Class Ⅱ)，Ⅰ类基因型病毒与Ⅱ类基因型病毒的遗传差异为41.0%～46.3%[16]。

疫苗免疫接种是预防新城疫的主要方法。20世纪50年代初，减毒活疫苗是唯一可用的ND疫苗类型，直至20世纪70年代，灭活疫苗才逐渐被使用[17]。减毒活疫苗和灭活疫苗各有利弊：减毒活疫苗可以直接进行口服免疫，并且活疫苗制作成本低廉，但如果饲养条件较差或者鸡群状态不健康时，则有可能引发疾病[18]；灭活疫苗则对抗原量需求较大，产生的细胞免疫水平较低，并且受佐剂的影响可能存在副作用，导致接受免疫的禽类产生炎症，而其中含有的芳香族化合物有致癌风险[19]。自20世纪80年代末以来，新城疫的基因工程疫苗成为了研究热点，虽然有制作成本高、免疫周期中每次免疫间隔时间短等缺点，但是其免疫完成后效力持续时间通常较长并且能减少已存在抗体的影响，因此，相关的研究一直在开展，是新型新城疫疫苗的主要研发方向[20]。基于此，本文对新城疫传统疫苗、载体疫苗和病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)疫苗等不同类型疫苗的研发现状与前景进行了分析，同时对纳米粒子、新型免疫佐剂在新城疫疫苗研发过程中的应用进展进行了总结，旨在为研究更廉价、高效、有针对性的新城疫疫苗提供参考，从而推进对新城疫疫情的防控。

1 新城疫疫苗的研发进展

接种疫苗有3个主要目标：减少或消除临床症状；降低强毒株的传播；增强对外来病毒感染的抵抗能力[21]。对于ND疫苗，判断其效力的指标是至少在2次疫苗接种后超过85%的鸡群的血凝抑制(hemagglutination inhibition，HI)抗体效价大于8[22]。传统的新城疫疫苗包括减毒活疫苗和灭活疫苗2种；自20世纪80年代以来，VLPs逐渐成为了一种安全有效的疫苗；进入20世纪90年代，利用基因工程改造病毒或细菌，再以此作载体表达特定免疫源性蛋白而形成的载体疫苗进入人们的视野；进入21世纪后，利用现代生物学手段来研发各种新型新城疫疫苗或者新的疫苗递送方式成为热点。

1.1 传统疫苗

传统的新城疫疫苗包括减毒活疫苗和灭活疫苗两种类型。减毒活疫苗通常是指用某些天然弱毒分离物或人工减毒的活病毒株制成的疫苗。从20世纪40年代开始，众多新城疫毒株被分离并被减毒，经过细胞传代后逐步发展为商业化的新城疫疫苗[23]。1948年，第一支针对新城疫的减毒活疫苗获批生产，是用能在雏鸡中引起病症的毒株(B1)所制备，仅适用于4周以上的鸡[24]。目前最常用的ND疫苗是由20世纪40年代诞生的减毒活疫苗制备而得，如从1946年分离出的H株和1947年分离出的LaSota株[25]。在早期分离出的毒株中，LaSota株在幼龄鸡中的复制能力最高，产生的中和抗体水平也最高，因此，LaSota疫苗株在强毒NDV流行的国家使用非常普遍[26]。减毒活疫苗可以激活粘膜和体液免疫功能，但这也可能引起临床呼吸道症状，使产蛋量下降，并且减毒活疫苗严格要求冷链运输，这些都限制了此类疫苗的应用[27]。澳大利亚国际农业研究中心生产的减毒活疫苗Ⅰ-2株解决了热稳定性的问题[28]，使其可以应用于环境温度较高的地区。关于如何提高新城疫疫苗热稳定性的研究仍在继续[29-30]。

灭活疫苗指对新城疫病毒进行灭活后添加佐剂制成的疫苗。第一款商业化新城疫灭活疫苗于1945年在美国开始销售，但由于其价格相对较高，并且防治效率也不能将疫情控制到足以值得广泛使用的水平，因此当时未被家禽业采用[31]。目前常用的鸡新城疫灭活疫苗，大部分是由LaSota株所制。20世纪70年代时，使用氢氧化铝作为佐剂的灭活疫苗被广泛使用，但是灭活疫苗的免疫原性较差，很快被减毒活疫苗取代[32]。直到性能优越的油乳剂灭活疫苗兴起之后才再次进入人们的视野。但油乳剂灭活疫苗在注入禽类体内后需要较长一段时间才能完全释放，通常需要10～20 d发挥效果以产生免疫力[21]。

尽管减毒活疫苗和灭活疫苗可以在禽类中起到良好的预防作用，但疫苗失效的情况时有发生[32]。导致疫苗失效的可能原因之一是疫苗接种反应差，这也取决于与疫苗本身无关的因素，如ND疫苗接种前的免疫抑制：各种不同的禽类病原体(如传染性支气管炎病毒、鸡胆疱疹病毒、传染性法氏囊病病毒和支原体属)都能产生免疫抑制作用[33]。由此可见，成功研制共表达不同病原体的抗原，同时诱导机体产生这几种病原体的免疫反应的疫苗将具有巨大的价值。

1.2 载体疫苗

20世纪90年代，利用基因工程改造病毒或细菌，再以此作载体表达特定免疫源性蛋白而形成的载体疫苗进入人们的视野。载体疫苗的优点是可以最大限度地不受接种动物体内NDV抗体的干扰[34]。近年来，使用其他禽类病毒作为载体开发抗NDV的重组疫苗是疫苗研发的重点方向。截至目前，包括禽痘病毒、火鸡疱疹病毒、传染性法氏囊病病毒等经修饰后都可作为疫苗的载体。在1990年，基于禽痘病毒(fowlpox virus，FPV)载体表达NDV的F蛋白和HN蛋白的重组载体疫苗被证明可以保护鸡免受强毒NDV的攻击[35]。随后，法国和美国的2个科研团队同样基于F蛋白和HN蛋白开发了多种重组疫苗，均具有免疫保护功效[36-37]。在我国，张体银等[38]和甘军纪[39]早期先后开发了基于禽痘病毒载体的新城疫疫苗。2015年，辛舒等[40]将NDVF基因构建到pTS2GFPV150质粒上，将重组质粒与禽痘病毒株FPV282E4共转染鸡胚成纤维细胞进行同源重组，获得重组病毒rFPV-F，经鉴定，该重组病毒可以在细胞内表达，同时具有良好的反应原性，为进一步开展免疫原性试验奠定了基础。

重组疫苗载体中使用同样广泛的还有火鸡疱疹病毒(herpesvirus of turkeys，HVT)，又称马立克氏病病毒(Marek’s disease virus，MDV)。1992年，Morgan等[41]将NDV的F蛋白插入HVT的非必需基因，开发了基于HVT载体的疫苗，并证明其对鸡的新城疫和马立克氏病同时具有保护作用。截至2013年，已经有2种商业化HVT(rHVT)疫苗[42]。2019年，Gergen等[43]构建了以HVT为载体的双重重组株(HVT-NDV-ILTV)，该株包含来自NDV的F基因和来自传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus，ILTV)的gD+gI基因，在NDV(GB Texas株)、ILTV(LT96-3株)和MDV(GA5株)毒株的攻击下生存率分别是97%、94%和97%。rHVT-ND疫苗可以在卵内或孵化后皮下注射，产生长期免疫力。但是rHVT-ND疫苗也存在一些缺点：①它们需要保存在液氮中，并要求在解冻后1 h内施用；②rHVT-ND需要至少在4周内每周连续使用才能达到完全免疫[44]。

此外，Li等[45]利用传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)载体表达NDV的HN蛋白，产生针对IBDV和NDV的抗体，能够分别在IBDV、NDV攻毒时使70%～80%、50%～60%的鸡得到保护。此后还出现了使用沙门氏菌作为载体的NDV疫苗等其他载体疫苗，但均尚未得到大规模的应用[46]。综上所述，目前常见的3种新城疫疫苗在实际应用中各有利弊(表1)，根据实际情况选择最适合的疫苗类型，才能使其效力得到充分发挥。

1.3 病毒样颗粒疫苗

病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)是由病毒的结构蛋白自行装配而成的高度结构化的蛋白结构，这其中不含有病毒的核酸部分，但在结构上VLPs与天然的病毒粒子结构相似，几乎具有原病毒粒子全部的免疫原性。VLPs是一种亚单位疫苗，能够诱导机体产生抗体，从而对同源病毒感染具有免疫效果，其本身也可以作为免疫系统的外来物而促进免疫，并且由于缺乏病毒基因组，VLPs不具有传染性，因此是一种理想的疫苗研发策略[49]。将含有编码病毒结构蛋白基因的载体转染细胞后，通过表达M蛋白或M蛋白与糖蛋白的组合蛋白或M蛋白与NP蛋白的组合蛋白，可以产生许多不同的副粘病毒VLPs，这些VLPs具有较高的释放效率[50]。Xu等[51]采用了杆状病毒表达系统(baculovirus expression system, Bac-to-Bac)，以NDV M蛋白为骨架，表面为保护性抗原F蛋白和HN蛋白，构建了基于基因型Ⅶ亚型NDV病毒株的病毒样颗粒(NDV VLPs)。该NDV VLPs疫苗与商业化的LaSota疫苗相比，刺激产生的保护期更长，组织病毒负荷更少，病毒脱落期更短。尽管尚未商业化，但利用不同NDV株的糖蛋白组装成VLPs以开发广谱的ND疫苗，具有广阔的应用前景。

表1 减毒活疫苗、灭活疫苗与载体疫苗的特性比较[47-48] Table 1 Comparison of the live attenuated, inactivated and carrier vaccines[47-48]

1.4 纳米粒子在新城疫疫苗递送过程中的应用

纳米粒子可以使疫苗免受母源抗体和核酸酶的影响，是一种理想的疫苗递送载体[52-53]。传统的疫苗递送系统，如在疫苗中添加胆固醇、磷脂等免疫刺激复合物能延长抗原的存留时间，但其刺激性较强、毒性较大，且更适合于在细胞免疫阶段起作用的疫苗，因此更高效、安全的纳米粒子递送系统成为研究热点[54]。有机材料和无机材料，如聚乳酸、聚(丙交酯-共-乙交酯)、壳聚糖、羧甲基纤维素、磷酸钙和磷酸镁，均可以用作纳米颗粒载体，并可以通过多种途径给药。具有代表性的有机材料——2种壳聚糖衍生物：O-20-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖和N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖，已被用于制造纳米粒子并作为ND疫苗的递送载体，这2种疫苗载体能产生比传统载体更高的淋巴细胞增殖水平，提供更强的免疫反应，并具有更高的安全性[54]。无机纳米粒子作为ND疫苗的递送载体的相关研究也一直在推进。Zhao等[55]开发了SiO2纳米粒子用于鼻内递送新城疫DNA疫苗，与直接将DNA疫苗进行肌肉注射相比，这些SiO2纳米粒子毒性更低，并诱导了更强的细胞和体液免疫应答，用强毒力的NDV F48E9毒株进行攻毒检验，保护效率为100%。与传统疫苗递送系统相比，纳米颗粒递送系统可以保护抗原免于被破坏，可控制抗原的释放并增加反应持续时间，因此以纳米粒子来实现疫苗的递送是未来疫苗发展的重要研究方向[54]。

1.5 新型免疫佐剂在新城疫疫苗中的应用

免疫佐剂(immune adjuvant)是指先于抗原或与抗原同时应用，可以非特异性地增强机体的特异性免疫应答、增强抗原免疫原性或改变免疫反应类型，而本身并无抗原性的物质[56]。传统的免疫佐剂包括铝盐佐剂、油乳佐剂、弗氏佐剂[57]。随着生物技术的发展，新型疫苗的研究不断深入，这些新型疫苗理论上比传统疫苗更安全，但由于免疫原性较弱、分子较小等原因并不能引起足够强度的免疫应答，而传统的免疫佐剂在新型疫苗中的作用有限[58]。因此，研发能辅助新型疫苗诱导或增强体液与细胞免疫应答的安全有效的新型佐剂成为热点。目前的研究主要围绕固有免疫受体的配体、细胞因子等展开。

Toll样受体(Toll-like receptors, TLR)是一种模式识别受体(pattern recognition receptor, PRR)，而先天免疫系统借助PRR特异性识别外来病原体。目前ND疫苗研究的一个方向就是通过使用TLR的配体作为佐剂，来增强疫苗效力[59]。以TLR信号途径为靶点的新型免疫佐剂的安全性和有效性较好，使其在佐剂的设计中越来越受到重视，成为免疫佐剂的又一重要发展方向[60]。Ramakrishnan等[61]证明了在给予了TLR-7配体R-848后，干扰素IFN-β、IFN-γ以及白细胞介素IL-1β、IL-4和TLR-7在鸡外周血单个核细胞中的表达显著上调，从而增强免疫力。另一种TLR配体疫苗是含有未甲基化的CpG基序的寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)，CpG能以TLR-9依赖的方式刺激机体免疫应答。含有CpG ODN的疫苗可以粘膜注射，安全性较高，能通过改善抗原呈递细胞的功能来提高共同施用疫苗的免疫原性，从而增强体液和细胞免疫反应，可作为新城疫和其他危害家禽的病毒疫苗的有效佐剂[62]。

细胞因子可以调节固有免疫和适应性免疫应答，随着研究的深入，人们发现细胞因子也可以作为免疫佐剂来增强疫苗的效力[63]。鸡IFN-γ(cChiIFN-γ)是一种巨噬细胞活化调节剂，可抑制病毒复制，通过抑制Th2细胞因子的产生促进Th1反应的发展，并增强抗原呈递作用[64]。2007年Rauw课题组构建了表达鸡IFN-γ鸡腺病毒血清型1(CELO)重组体，可以抑制鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblast, CEF)中溶细胞病毒(cytolytic virus, CLV)的复制并激活巨噬细胞，促进Th1反应，增强抗原提呈作用[65]。Susta等[66]以强毒力NDV毒株为载体表达鸡的IL-2，能够降低鸡血液、脾脏和粘膜分泌物中的病毒载量，但死亡率未出现明显变化，与之相比，在同种毒株基因组中插入IFN-γ后，鸡发病率和死亡率都有明显降低[67]。IFN-γ作为佐剂，已被证明可改善疫苗对不同禽类病原体的保护并增强免疫反应，然而IFN-γ的表达和纯化成本较高，且需要多次注射使用，不适合大规模的家禽养殖，因此对其的商业化开发仍需要进一步评估[68]。

值得注意的是，TLR配体和细胞因子的免疫调节功能的发挥取决于多种因素，如病原体的类型、免疫接种的时间点以及递送的TLR配体或细胞因子的数量等[69]。这也说明，新型疫苗进入商业化阶段还有一段距离。

2 新城疫疫苗的商业化

目前，常见的商业化的新城疫疫苗仍以传统疫苗为主。但国内外市场上常见的新城疫疫苗还有些差异。

2.1 国内市场常见的新城疫疫苗

商业化的新城疫疫苗目前仍以传统疫苗为主。在我国新城疫减毒活疫苗主要有2类：中等毒力的Ⅰ系疫苗和低毒力的Ⅱ系、Ⅲ系、Ⅳ系疫苗及其克隆株等。国内的大多数兽用疫苗公司均生产减毒活疫苗；商业化灭活疫苗相对于减毒活疫苗应用较少，我国市场上的灭活疫苗主要由LaSota、Clone 30 2种毒株制备而成，佐剂均为油佐剂,瑞普生物、华派、和诺倍威-易邦等公司都有相应的产品，在2014年扬州大学联合8家企业开发了A-Ⅶ株灭活疫苗，是世界首例重组新城疫病毒灭活疫苗，目前诺倍威-易邦生物等公司有生产销售[70]。表2对国内市场上主流的新城疫减毒活疫苗和灭活疫苗进行了总结。

2.2 国外市场常见的新城疫疫苗

在国际范围内，Ceva、Zoetis、MSD和LAH等公司都有在多个国家销售的新城疫疫苗。减毒活疫苗方面，除了较为常见的LaSota、Clone 30、V4、Hitchner B1等毒株的疫苗，Ceva还开发了PHY-LMV-42毒株的减毒活疫苗，墨西哥的Investigacion aplicada公司开发了rP05的基因V型重组疫苗，将基因工程疫苗的技术成功应用到了减毒活疫苗中。灭活疫苗方面，除了常见的LaSota灭活疫苗，韩国的KBNP公司还开发了KBNP-C4152R2L株(genotype Ⅶ)灭活疫苗。MSD AH还有基于新城疫P201株开发的、专门针对鸽新城疫的灭活疫苗。除了少数疫苗，如罗马尼亚的Romvac公司开发了一款应用氢氧化铝胶体佐剂的LaSota株灭活疫苗，大部分灭活疫苗的佐剂都为油佐剂。表3对国际市场上主流的新城疫减毒活疫苗和灭活疫苗进行了总结。

表2 国内市场常见新城疫疫苗Table 2 Common newcastle disease vaccine in domestic market

表3 国际市场常见新城疫疫苗Table 3 Common newcastle disease vaccine in international market

3 展望

已有的应对疫情的经验表明，应对大规模感染，严格检疫与快速诊断并行的同时，有效的商业化疫苗是防控的第一选择。从现有商业化疫苗发展情况来看，灭活疫苗接种剂量较大，接种后通常需2～3周后才能产生免疫力，不能用作紧急预防免疫；减毒活疫苗能刺激产生局部免疫，免疫后很快得到保护。但最近的NDV分离株的基因分型表明，由于所用的疫苗株与当前流行株之间的基因存在差异，免疫过的家禽群中也会存在不同程度地感染NDV的情况。20世纪50年代建立的疫苗株(如LaSota等)可能正在失去对21世纪的新毒株的免疫效力。利用基因工程技术开发的新型疫苗虽然安全性高、稳定性好、便于保存运输，但是限于成本等原因目前仍少有进入市场销售阶段的疫苗，故目前市场仍然采用“减毒活疫苗+灭活疫苗”的免疫程序进行鸡新城疫的预防，这对我国养禽业的发展造成很大的阻碍。同时现今对禽类NDV免疫反应的认识也不够完整，从全世界范围内疫情的多次暴发中可以明显看出，现有的各种疫苗在不同的环境条件下并不完全有效，因此需要加强对NDV的免疫反应的认识。更详尽的阐释NDV的免疫反应机制仍是制定针对ND疫情控制策略以应对再次爆发的疫情的首要任务，也更有助于开发新种类的疫苗。未来的ND疫苗的发展趋势是靶向针对新诞生的NDV毒株，以及可以跨基因型免疫保护的疫苗类型，结合佐剂和纳米递送系统，将比现有单一针对性的疫苗更具优势。对我国而言，Class Ⅱ的Ⅶ亚型是造成新城疫疫情最主要的毒株类型[71]，开发针对Ⅶ亚型能产生免疫效力的疫苗将是我国新城疫疫苗开发的主要目标。