柯萨奇病毒A组16型的研究进展

马士恒，李明

(河北大学附属医院感染性疾病科，河北 保定 071000)

柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A group 16 strain,CA16)属于微小核糖核酸(microRNA,miRNA)病毒科，人肠道病毒属。可引起手足口病、无菌性脑膜炎、脑炎、心肌炎和肌肉麻痹等疾病。近年来有关CA16的研究越来越受到重视。

1 CA16的流行病学

有研究[1]显示，广东省2014年估算发病率可达113.0/10万，暴发时以CA16感染为主, 可占54.6%。 1～2岁年龄组发病率最高 (1 449.2/10万)，后随年龄升高发病率呈下降趋势，高发月份是5月至6月，发病率分别为143.9/10万、131.5/10万,托幼机构儿童容易发生，并发现CA16感染水平越高时,越容易发生暴发疫情。在昆明市2013—2018年重症手足口病病例标本中，明确由CA16型引起的有111份，占9.09%[2]。

在中国北方地区，2013—2016年北京市东城区手足口病年均发病率为68.13/10万, CA16占比最高达36.31%。发病以0～5岁儿童为主, 占80.80%。男女比例为1.48︰1[3]。另有研究[4]显示，北京及其周边地区2018年儿童手足口病中CA16引起的病例占14.31%，虽然有所下降，但仍是主要病原体。河北省2008—2017年累计报告手足口病病例690 368例, 年均发病率为95.53/10万。其中重症4 939例,死亡208例, 死亡病例年龄较低，CA16与肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)交替成为主要病原体[5]。

有学者[6]研究了中国农村地区CA16所致疾病导致的经济负担，共调查299例CA16感染病例,疾病造成的经济负担人均1 958.83元。在农村地区CA16感染所致疾病负担仍较重,积极防控CA16感染所致疾患有重要的社会意义。

国外有关CA16感染的报道也较多，CA16常是大规模手足口病流行时的主要病原体[7]。

2 病原学及致病性

原型CA16株CA16-G10首先在南非分离成功，1994年测定了RNA序列。CA16也是不断发生变异的,在中国流行的过程中，CA16曾与多种肠道病毒(如CA4和 EV71)重组。病毒的5′非编码区(207～647 bp)与CA4的相似性最高。大部分P1区域与原型CA16-G10相似。非结构蛋白区(P2和P3)有一个1.5 kb的片段(4406～5854 bp)，与EV71最相似[8]。

有学者[9]研究了2017年西宁市流行的10株CA16可划分为2个基因亚型，其中3株为B1a基因亚型，7株为B1b基因亚型。而2018年CA16流行株则只有B1b基因亚型，氨基酸同源性较高，但存在差异。提示B1b基因亚型是本市流行优势株，引起流行的CA16来自不同的传播链，病毒在传播过程中不断发生变异。

CA16外壳蛋白由VP1、VP2、VP3和VP4组成，其中VP1 为最重要的抗原决定簇。王杨等[10]采用实时荧光PCR检测患者粪便标本中的CA16病毒核酸,并进行反转录扩增VP1基因,然后进行测序，并确定其所属基因型。结果发现2015—2017年云南省160株CA16均为B2亚型，与福建省、北京市、南京等地CA16流行毒株遗传距离为0.76,与马来西亚的遗传距离为0.78,与澳大利亚的遗传距离为1.86。说明云南省CA16流行株与国内及东南亚地区相似, 而与距离较远的澳大利亚流行毒株差异较大，也表明传播中的病毒不断发生变化。

姚相杰等[11]研究了深圳市2016—2017年来源于CA16感染患者的VP1基因特征，结果显示，2016—2017年深圳地区CA16进化群主要分为B1a亚型、B1b亚型,还新发现了B3亚型，B3亚型为中国最新出现的CA16流行株。深圳地区2016—2017年CA16流行株与CA16重症株比较,共发现了两个氨基酸突变位点,分别为VP1蛋白的S14N和M23L。

CA16与EV71是手足口病的两种主要病原体,二者基本相似，非结构和保守结构蛋白具有相似的功能。由CA16感染引起的严重手足口病患者表现为心肌炎和肺炎,但较少出现中枢神经系统并发症。而EV71感染常引起脑炎等严重并发症。有研究[12]显示，CA16与EV71比较， CA16 引起的手足口病患儿发病年龄更低、发热病程短、更易出现白细胞升高。宿主对CA16和EV71感染免疫应答存在差异，不同病毒感染引起的手足口病发病机制不同。这意味着对不同病毒引起的手足口病应制定不同的治疗策略[13]。

在一项有关手足口病研究[14]中，经病原学确诊出673例CA16阳性患儿、374例CA6阳性患儿。两组患儿在平均发病年龄、齿龈部疱疹分布、发热程度、C反应蛋白和白细胞异常情况等方面均存在差异。说明不同肠道病毒引起的手足口病临床表现也存在明显差异。

3 发病机制

CA16依赖于细胞的胞吞作用进入到细胞内，位于细胞内涵体的Toll样受体3可感知CA16感染，并诱导干扰素产生，诱发机体对CA16感染的保护性免疫应答。有研究[15]发现，CA16可通过其3C蛋白竞争性地抑制抗黑色素瘤分化相关基因5(又称为干扰素诱导的解旋酶C结构域，主要参与病毒的固有免疫反应)与线粒体抗病毒信号蛋白的结合，阻断向下游信号通路的信号传导。另外通过其蛋白水解酶活性，剪切下游通路的关键蛋白转化生长因子激酶1，从而抑制该信号通路的正常激活，有效抑制固有免疫，逃避免疫系统的识别和攻击，进而促进病毒复制，引起病理损害。

miRNA为长度约为22个核苷酸的非编码RNA。越来越多的研究表明，细胞起源的miRNA分子可能参与了细胞对病毒感染的防御，而病毒来源的miRNA可能增强病毒在宿主细胞中的复制和生存。miRNA失调与许多疾病有关，包括癌症、神经发育障碍、心血管疾病和大多数炎症性疾病[16]。

有研究[17]发现,CA16与EV71感染人类支气管上皮细胞后, miRNA有 201个在表达上呈现出两倍以上差异, 65个miRNA 出现相反的变化，从而使呼吸道上皮屏障损伤出现差异。与EV71感染相比,CA16感染时病毒复制更快,上皮细胞间通透性破坏更严重，细胞凋亡更常见。CA16感染CD1c+树突状细胞后可导致大量干扰素产生,使CA16病毒载量下降, 并能增强辅助性T细胞1与调节性T细胞相关的转录因子表达。该研究结果显示,CA16与EV71感染恒河猴CD1c+树突状细胞后，引起差异性的miRNA表达，进而出现不同的免疫应答反应,最终导致病理变化和临床表现的差异。

有研究[18]在幼年恒河猴体内成功模拟CA16的基本致病过程，进一步用安捷伦全基因组微阵列和已建立的生物信息学工具进行了全基因组表达分析。鉴定出948个差异表达的基因，包括细胞信息传递、细胞周期、免疫过程、转录调节和代谢过程。PANTHER通路分析显示炎症主要由趋化因子、白细胞介素信号通路和细胞因子信号通路所介导。这项初步的微阵列研究深入探讨了CA16感染的分子发病机制。

4 动物模型

利用小鼠作为CA16感染的动物模型获得成功，该模型可用于评估抗CA16药物和疫苗的效果[19]。在小鼠感染3～6 d即可发现CA16在肌肉组织中大量复制，感染9 d时脑组织中出现病毒，说明了病毒的嗜神经性。将CA16接种到新生小鼠腹腔内，可引起小鼠脑部神经元损伤，7 d后小鼠可出现瘫痪并可导致死亡。进一步研究显示，给小鼠注射致死量的病毒1 d 后，注射抗CA16单克隆抗体，发现有100%的治疗效果。该研究结果表明,该模型可很好评估抗CA16单克隆抗体在动物体内的治疗效果。研究中还发现CA16感染病情轻重与小鼠的日龄有关，日龄越小，感染病毒后临床表现越重。不同CA16病毒株对模型小鼠的致病力也有差异，说明了该动物模型的有效性。

采用微量注射器将CA16对树鼩进行鼻腔接种，结果表明，幼龄树鼩可被CA16感染，并出现发热等类似于患者的临床表现，其病理变化与患者的病理改变相似。进一步的病毒检测发现模型树鼩的咽拭子、血液、粪便和内脏器官组织中存在CA16。这些结果表明树鼩可作为研究CA16感染的一种很好的动物模型[20]。

将 CA16经鼻腔灌流感染 6～8个月的猕猴，建立猕猴模型[21]，结果显示，12只猕猴均表现出体温升高、典型口腔黏膜和四肢小泡。猕猴外周血在病毒攻毒后 3～9 d病毒血症达到高峰，同时在这些模型动物的咽喉拭子和粪便中也发现了同样的病毒峰值。组织病理学检测发现淋巴结、气管、食道、甲状腺和胸肌都发现了病毒的增殖。模型动物的大多数内脏器官和组织未见病变。另外可见这些猕猴外周血中单核细胞和自然杀伤细胞的比例也有增加。猕猴模型的成功建立给以后的治疗药物及疫苗的研发提供了很好的工具。

5 检测

CA16是手足口病的主要病原体，但其他肠道病毒引起的手足口病也不容忽视，开发一种能同时检测出多种病毒的多重实时逆转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR assays， rRT-PCR)方法是必要的。利用taqman探针进行了rRT-PCR检测，用于区分三种常见肠道病毒(CA16、EV71和CA6)，并使广泛的肠道病毒检测成为可能[22]。该方法对CA16、EV71和CA6的检测下限均为每微升10个拷贝。准确度(CA16，100%；EV71，90.6%；CA6，92.0%)、灵敏度(CA16，99.0%；EV71，96.5%；CA6，95.8%)和特异性(CA16，99.9%；EV71，100%；CA6，99.9%)均优于常规RT-PCR。多重rRT-PCR技术能够对CA16、EV71和CA6肠道病毒进行高灵敏度检测和快速分型，为大规模监测手足口病相关肠道病毒感染提供了很有价值的诊断方法。

有学者开发了应用胶体金免疫层析法(colloidal gold immunochromatographic assays,CGIAS)检测CA16-IgM和EV71-IgM[23]。该研究收集手足口病患儿、非手足口病患儿及健康儿童血清1 465份。IgM-CGIA检测对EV71和CA16的敏感性分别为97.6%(330/338)和91.6%(296/323)，而对病毒RNA呈阳性反应。其性能与市售ELISA试剂盒相当，EV71-IgM和CA16-IgM的一致性分别为98.1%和97.3%。此外，全血标本检测的结果EV71-IgM和CA16-IgM分别为99.6%(248/249)和100%(191/191)。可作为现场快速的检测方法，两种CGIAS均适用于社区门诊，特别是对资源相对贫乏地区的病原学诊断意义更大。

另有学者建立了基于重组荧光病毒CA16-EGFP的流式快速测定CA16感染及动物血清中和抗体效价的方法[24]。用CA16-EGFP感染Vero细胞,利用流式细胞仪检测不同病毒滴度下的EGFP阳性细胞数量、EGFP阳性细胞百分比以及EGFP阳性细胞的平均荧光密度值,明确三者之间数值对应关系。利用该检测方法对CA16感染恒河猴血清及CA16免疫的羊血清中和抗体效价进行测试。结果与传统的微量中和实验相比差异无统计学意义。利用流式荧光检测可以迅速检测CA16中和抗体效价,与传统的微量中和实验有较好的一致性。其优点是更简单、快速、灵敏。

6 疫苗

由于CA16的高流行率，开发CA16疫苗成为全球的研究热点。有学者[25]探讨了人二倍体细胞制备的EV71灭活疫苗在CA16感染下的反应，观察指标包括动物的体温，血、口咽和粪便中的病毒载量,特异性中和抗体等，结果显示，EV71疫苗免疫猴在CA16感染后，血清中促炎细胞因子释放等方面无明显变化。表明EV71灭活疫苗诱导的特异性免疫应答对预防CA16感染无效。

利用反向遗传学技术构建了一株VP1/210-225表位被CA16表位取代的嵌合EV71[26]。VP1/210-225表位的替换对EV71的抗原性和免疫原性没有显著影响，结果显示，该疫苗株可保护新生小鼠免受EV71和CA16致死性感染，嵌合的EV71可诱导针对EV71和CA16均有的保护性免疫反应。说明CA16嵌合的EV71是一种可行的、有前途的针对EV71和CA16二价疫苗。嵌合肠道病毒的构建也为更广谱手足口病疫苗的开发提供了一个新的平台。

另有研究[27]揭示了EV71类病毒颗粒和嵌合EV71/CA16类病毒颗粒的晶体结构，发现EV71的主要中和表位在这两种类病毒颗粒中保存很充分。嵌合体类病毒颗粒中突变的VP1gh环在粒子表面暴露良好，显示出不同于EV71类病毒颗粒中原始的VP1gh环所导致的表面电荷势能。这项研究证明了酵母产生的类病毒颗粒可以发展成为新型的CA16和其他肠道病毒相关疾病疫苗。

Zhang等[28]研究了CA16类病毒颗粒在毕赤酵母中的表达及其对小鼠的免疫原性和保护作用。发现用一个共同表达CA16的P1和3cd蛋白的结构体转化酵母，可以高水平产生CA16的类病毒颗粒，用CA16类病毒颗粒免疫小鼠，可在小鼠体内诱导出针对CA16的高效价中和抗体。在进一步的血清转移实验中，酵母源类病毒颗粒的被动免疫可完全保护新生小鼠免受CA16致死感染。该结果表明，此CA16类病毒颗粒是一种很有前途的CA16候选疫苗，具备成本低、操作简单、免疫原性好等特点，具有较好的产业化前景。

张浩然等[29]研究了氢氧化铝佐剂、N,O-羧甲基壳聚糖纳米粒佐剂CA16灭活疫苗在不同免疫方式、不同剂量对小鼠体液免疫应答的影响，并设阴性对照组。疫苗注射量为200微升/只,共接种2次,间隔4周。分别在第二次接种前、第二次接种后的第14、28天采集小鼠尾静脉血，采用微量中和试验检测小鼠血清抗体水平。结果显示氢氧化铝佐剂CA16灭活疫苗的抗体几何平均滴度值和中和抗体阳转率最高，其高剂量组的抗体几何平均滴度值和中和抗体阳转率均高于低剂量组，皮内注射组优于肌肉注射组。说明氢氧化铝佐剂CA16灭活疫苗高剂量、皮内注射免疫方式可很好地诱导出小鼠的体液免疫应答。

包括CA16型在内的多价手足口病疫苗的研制也有报道。有学者[30]将CA16、CA6和CA10在不同条件下用福尔马林或β-丙内酯灭活，两种灭活方法均能诱导出相似的免疫应答，且β-丙内酯灭活后CA16和CA10的免疫效果优于福尔马林。双价或三价疫苗组也诱导出了足够的中和抗体和细胞介导的免疫应答，提示双价或三价CA16、CA10和CA6疫苗可能成为多价疫苗候选株。

CA16病毒的研究近年虽然有诸多进展，但临床治疗上主要还是以对症治疗为主，抗病毒治疗方面仍无突破，相关药物的研发有待加强。