依达拉奉对急性脑梗死大鼠的保护作用及生长分化因子15的影响①

焦光美 单海雷 马 征 张晓璇 康玲伶 窦志杰 王 东 杨 宁 赵 亮

(承德医学院附属医院神经内科,承德 067000)

急性脑梗死是一个严重威胁生命及生活质量的因素，尤其对于老年人及三高人群，是导致死亡和致残的主要原因。该病变给患者及其家庭造成了严重的经济负担及精神负担，因此也引起了社会的广泛关注[1]。急性脑梗死会造成机体多方面的损伤。缺血性脑卒中损伤中氧化应激是一个重要而持续造成损伤的机体反应，依达拉奉是临床上常用的一种自由基清除剂，在脑梗死急性期的临床治疗上有着较广泛的应用[2,3]。依达拉奉可逆转自由基诱发的细胞毒性作用从而发挥神经保护作用，并可保护脂质的氧化和避免细胞内皮进一步受损，起到减小梗死体积、减轻脑水肿、延迟神经元凋亡，避免神经功能过度损伤的作用。虽然临床应用广泛，但对于依达拉奉的作用机制仍然有很大的研究空间[4,5]。生长分化因子15(growth differentiation factor-15，GDF-15)是TGF-β超级家族中的一员，是反映心血管生理病理进程的独立性生化标志物，并且与冠心病、心肌梗死关系密切。研究表明，GDF-15与多种心脑血管疾病的发生及进展有关[6]。基于此，本研究针对依达拉奉对急性脑梗死大鼠(middle cerebral artery occlusion,MCAO)的保护作用是否与调节GDF-15的表达有关进行研究，并通过研究GDF-15下游蛋白Smad2的表达进一步阐明在急性脑梗死中依达拉奉的作用机制，发现依达拉奉可调节MCAO脑中GDF-15及其下游蛋白Smad2的表达。本研究结果为依达拉奉临床应用的新作用机制提供科学证据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 成年雄性SD 大鼠，SPF级，购自北京维通利华实验动物中心[合格证号：scxk(京)2013-0008]，体重250～300 g，共66只。持续保持动物实验设施在屏障环境标准，室温为18℃～26℃，温差不超过4℃；维持相对湿度为40%～70%，光照每12 h替换；其余饲养条件都符合中华人民共和国国家标准GB14925-2010规定。

1.1.2试剂与仪器 依达拉奉注射液购自吉林博大制药有限公司，批号：02-1608102。戊巴比妥钠购自天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20161114；RT-PCR试剂盒购自美国promega公司；山羊抗人GDF-15多克隆抗体、鼠抗人Smad2单克隆抗体、鼠抗人GAPDH单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；PCR仪购自美国TeehneTouehgene公司。

1.2方法

1.2.1MCAO 模型的制作 大鼠MCAO模型复制参考 Longa 等[7]的改良线栓法，所有大鼠均以线栓栓塞左侧大脑中动脉。大鼠腹腔内注射1.5%戊巴比妥钠(3 mg/kg)进行麻醉,仰卧位固定后,去除颈部皮毛，皮肤表面消毒后于正中纵向切口，暴露左侧颈总动脉并钝性分离，用动脉夹暂时夹闭。结扎颈外动脉远端并切断，并将颈外动脉残端结扎以阻止血流，松开夹闭颈总动脉的动脉夹，线栓由残端插入颈外动脉，插入深度约17～19 mm 处，遇阻力则停止。颈前切口缝合并表面消毒。经多普勒血流仪检测显示颅内血流值低至基线值 30%以下，则表示大脑中动脉栓塞模型制备成功。假手术组动物进行相同的操作，但仅暴露血管，不进行栓塞。

1.2.2分组给药 造模成功的大鼠共48只随机分为模型组、依达拉奉低剂量组(1.5 mg/kg)、依达拉奉高剂量组(3 mg/kg)，并以假手术组作为对照。依达拉奉高、低剂量组在术后1 h给予不同剂量的依达拉奉注射液，假手术组、模型组给予等量生理盐水，依达拉奉剂量及给药时间参考文献[8]和[9]设定，文献报道尾静脉注射依达拉奉3 mg/kg治疗大鼠MCAO模型取得显著的效果，因此我们使用依达拉奉3 mg/kg作为高剂量及参考方法使用0.5倍剂量作为低剂量探索其治疗大鼠MCAO模型的机制。

1.2.3神经功能缺损评分 大鼠大脑中动脉闭塞4、10、24 h后，双盲法由两名实验人员根据改良神经功能缺损评分标准进行大鼠神经功能评分[7]。标准：0分表示无缺陷；1分表示对侧前肢不能完全伸展；2分表示对侧前肢不能伸出；3分表示轻微的向对侧转圈；4分表示严重的向对侧转圈；5分表示向对侧倾倒。

1.2.4TTC 染色及梗死体积测量 大鼠经神经功能缺损评分后TTC染色法进一步验证依达拉奉对急性脑梗死大鼠的保护作用。腹腔注1.5%戊巴比妥钠麻醉后快速取出大脑，立即将完整脑组织放入-20℃冰箱中，经过20 min冷冻后从前向后用大鼠脑切片模具将脑组织切成2 mm厚的脑片，共5片。将脑片轻放入预先配制的4%TTC染液中，并在37℃恒温箱中避光染色10 min后，每隔5 min对脑片进行晃动、翻面一次，以使得脑片着色均匀。染色均匀后将脑片放入PBS溶液中洗涤去除多余染色液，将脑片用4%多聚甲醛溶液进行固定，24 h后即可拍照。使用Image J图像分析软件圈画出梗死区域面积及全脑面积并进行计算，梗死体积=[(梗死对侧体积-梗死侧非梗死区体积)/梗死对侧体积]×100%。

1.2.5GDF-15、Smad2 mRNA表达测定 造模24 h，大鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥麻醉致死，取大脑研磨后，加入Trizol 进行裂解，采用RNA 提取试剂盒分离提取大脑中的总mRNA。测定总mRNA 浓度，符合要求后，采用cDNA合成试剂盒合成模板cDNA并进行RT-PCR。测定GDF-15、Smad2 mRNA的表达水平。RT-PCR引物序列：GDF-15:Forward:5′-CATTGCCTAGCGAGCGACG-3′,Reverse:5′-GGTAGGCTTCGGGAGACC-3′;Smad2:Forward:5′-TCC-ACCCGGCACTACAATCT-3′,Reverse:5′-CCATCAC-CGACCATCAGACCTGG-3′。

RT-PCR实验运用7500 system software分析结果，得出各组内参基因和目的基因的Ct值，相对定量采用2-ΔΔCt分析方法，设定模型组中目的基因与GAPDH的相对表达量为1，计算其他组别相对应模型组的表达量，以此表示假手术组及药物干预组的目的基因相对表达量与模型组的差别。

1.2.6GDF-15、Smad2蛋白表达测定 造模后24 h，1.5%戊巴比妥麻醉处死大鼠，取大脑组织于蛋白裂解缓冲液中匀浆,分离提取各个大鼠大脑总蛋白。总蛋白浓度测定符合要求后，蛋白于SDS-PAGE 胶上进行电泳分离并转膜。5%脱脂牛奶封闭，于4℃摇床中一抗(1∶1 000)孵育过夜，PBS洗膜3次，二抗(1∶5 000) 孵育1.5 h，PBS洗膜3次，ECL化学发光试剂盒显像。利用化学发光荧光成像仪的MI软件中的图像分析功能对条带灰度进行分析，计算目的蛋白条带与内参条带灰度值的比值作为半定量结果。

1.2.7苏木素-伊红(HE)染色 造模24 h后，大鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥麻醉致死，取大脑视交叉前后2 mm冠状切片组织块置于10%甲醛溶液中固定，进行常规石蜡切片，厚度为4 μm，HE染色，中性树胶封片后于LEICA DMLB型光学显微镜下观察大鼠脑组织形态学变化。

2 结果

2.1依达拉奉对MCAO大鼠神经行为的影响 与假手术组比较，模型组大鼠神经行为评分在缺血4、10、24 h均显著增加(P<0.05)；与模型组比较，依达拉奉低、高剂量组大鼠在缺血4、10、24 h神经行为评分均显著降低(P<0.05)。见表1。

2.2依达拉奉对MCAO大鼠大脑梗死面积的影响 与假手术组比较，模型组大鼠脑梗死面积显著增加(P<0.01)；与模型组比较，依达拉奉低、高剂量组大鼠脑梗死面积显著减少(P<0.05)。见表2、图1。

2.3依达拉奉对MCAO大鼠大脑GDF-15 和Smad2 mRNA表达的影响 与假手术组比较，模型组大鼠大脑GDF-15 和Smad2 mRNA的表达水平明显升高(P<0.05)。与模型组比较，依达拉奉低、高剂量组大鼠大脑GDF-15 和Smad2 mRNA的表达水平明显降低(P<0.05)，见图2。

表1 依达拉奉对MCAO大鼠神经行为的影响
Tab.1 Effect of edaravone on neurobehaviour in MCAO rats

GroupsDose(mg/kg)nNeuro-behaviour4h10h24hSham-operatedgroup-12000Modelgroup-128.60±0.881)8.00±0.971)7.60±1.151)Lowdosegroupofedaravane1.5124.90±1.062)4.50±1.352)4.30±0.882)Highdosegroupofedaravane3123.70±1.073)3.10±1.583)2.80±0.823)

Note：Compared with sham-operated group,1)P<0.01;compared with model group,2)P<0.05,3)P<0.01.

表2 依达拉奉对MCAO大鼠大脑梗死面积的影响
Tab.2 Effect of edaravone on cerebral infarct size in MCAO rats

GroupsDose(mg/kg)nCerebarlinfarctsize(%)Sham-operatedgroup-60Modelgroup-635.44±4.211)Lowdosegroupofedaravane1.5628.25±8.802)Highdosegroupofedaravane3624.49±5.273)

Note：Compared with sham-operated group,1)P<0.01;compared with model group,2)P<0.05,3)P<0.01.

图1 各组大鼠大脑的梗死面积Fig.1 Infarct size of rat brain in each groupNote:A.Sham operation group；B.Model group；C.Edaravone low dose group；D.Edaravone high dose group.

图2 各组大鼠大脑的GDF-15 和Smad2 mRNA表达水平Fig.2 Expression levels of GDF-15 and Smad2 in brain of rats in each groupNote:1.Sham operated group;2.Model group;3.Low dose group of edaravane；4.High dose group of edaravane.Compared with sham-operated group,#.P<0.05,##.P<0.01;compared with model group,*.P<0.05,**.P<0.01.

图3 各组大鼠大脑GDF-15和Smad2的蛋白表达条带与其统计Fig.3 HE staining results of rat brain in each groupNote:1.Sham-operation group；2.Model group；3.Low dose of edaravone group；4.High dose of edaravone group.Compared with sham-operartion group，##.P<0.01;compared with model group,*.P<0.05,**.P<0.01.

图4 各组大鼠大脑HE染色结果Fig.4 Protein bands of GDF-15 and Smad2 in brain of rats in each group and their statistical mapsNote:A.Sham-operation group;B.Model group;C.Low dose group of edaravane;D.High dose group of edaravane.

2.4依达拉奉对MCAO大鼠大脑GDF-15 和Smad2 蛋白表达的影响 与假手术组比较，模型组大鼠大脑GDF-15 和Smad2的蛋白表达水平明显升高；与模型组比较，依达拉奉低、高剂量组大鼠大脑GDF-15和Smad2蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)，见图3。

2.5依达拉奉对MCAO大鼠大脑组织病理形态学的影响 图4结果显示，假手术组脑组织未见结构异常。模型组各个大鼠大脑皮质均见有缺血区病灶、淡染、组织结构紊乱；大脑白质结构破坏；脑组织充血、水肿。部分样本见神经组织坏死、液化形成的圆形或卵圆形、边界清楚的镂空筛网状软化灶，脑皮质神经元胞体缩小、尼氏小体消失、细胞间隙增宽。依达拉奉低、高剂量组，大脑皮质亦见有缺血区病灶，淡染，组织结构紊乱程度较模型组有改善，部分样本均见大脑白质结构破坏；样本也观察到神经组织坏死、大脑皮质神经元胞体缩小、细胞间隙增宽等情况。病变程度较模型组轻。依达拉奉高剂量组病变程度较模型组及低剂量组轻。

3 讨论

急性脑梗死，包括缺血性和出血性脑梗死，都有着极高的致残率和致死率[1]。依达拉奉是日本三菱制药有限公司开发的自由基清除剂，并于2001年上市[2,10]。由于依达拉奉低脂溶性高，容易通过血脑屏障到达脑组织，因此对于脑缺血后的脑神经组织具有强大的保护作用，作为一种有效的脑神经保护剂广泛应用于临床[11]。目前研究发现其机制主要是清除自由基、降低脂质过氧化，并能调控细胞凋亡相关基因的表达，保护脑细胞、血管内皮等免受过氧化损伤[11-14]。脑梗死后可诱发MAPK信号转导通路的激活，JNK磷酸化程度升高，使得神经元损伤加重，依达拉奉的治疗可明显抑制MAPK通路 JNK的表达，减轻氧化应激后神经元的损伤[15]。出血事件通常会引起血脑屏障的损伤，基质金属蛋白酶(matrix metalloprotein，MMPs)大量增加，而MMP-9的大量增加会进一步加剧神经元损伤、凋亡及血脑屏障受损，依达拉奉干预后，可使血清中MMP-9的含量明显降低，使得缺血性脑梗死后的血脑屏障受损程度降低[16]。

GDF-15是TGF-β细胞因子超家族的一个成员，广泛表达于各组织中，被认为是心血管生理病理过程的独立生化标记物，其含量的大量升高可反映冠心病、急性脑梗死、心肌梗死等严重病变的发生[17]。多项研究表明，随着急性脑梗死病情的加重，GDF-15的表达水平显著升高，大量的GDF-15浸润病变组织相关的神经元，使神经元受损[6，18]。此外，GDF-15参与脑梗死后大脑的应激反应，使得炎症反应加剧[18]。从多方面看，降低脑梗死后GDF-15的表达水平对脑神经组织的保护有着十分重要的意义。本研究针对这个方面，研究依达拉奉对急性脑梗死脑神经损伤的保护机制是否与GDF-15表达的调控有关。结果显示大鼠MCAO造模后，大脑中切片可见明显的梗死区，且神经行为学评分明显升高，脑组织病变程度严重，可见造模成功，而该MCAO大鼠大脑中GDF-15及其下游信号分子Smad2的mRNA及蛋白表达水平明显升高，该结果与目前报道的结果一致。当机体受到损伤时，受损区域会释放TGF-β，其与细胞表面的受体结合可正反馈促使TGF-β磷酸化，该效应会激活Smad通路，而Smad通路也受GDF-15调节，有研究显示急性脑梗死后Smad2的表达水平明显升高[19]。给予不同剂量的依达拉奉干预后，大鼠神经行为学评分明显下降，脑梗死面积明显减少，且脑组织病变程度大大减轻，同时，脑组织中GDF-15及其下游信号分子Smad2的mRNA及蛋白表达水平明显下降，且以3 mg/kg剂量更为明显。该结果可能与脑梗死后使用依达拉奉的治疗时间有关，有研究显示在急性脑梗死后1～3 h使用依达拉奉的脑神经保护作用较好，而依达拉奉静脉给药剂量达到3 mg/kg能有较显著的疗效[8]。

依达拉奉临床应用有十多年，而其作用机制仍有很大的研究空间。明确的作用机制对于临床药物应用有十分重要的意义，本研究为依达拉奉临床治疗急性脑梗死的治疗机制提供科学依据，依达拉奉或可用于其他GDF-15升高的病变治疗，但仍需更多的证据支持。