CD14、TLR4基因多态性与百色地区原住壮族人群脊柱结核易感关联性研究①

蓝常贡 龙丽珍 谢克恭 刘 佳 周兰岛 潘生才 梁俊卿 涂振阳 高子然 唐毓金

(右江民族医学院附属医院骨科，百色 533000)

研究表明，TLR4和CD14是内毒素或脂多糖(LPS)介导的信号传导通路中的两个受体。CD14与LPS-LBP结合形成LPS/LBP/CD14复合物，TLR4-MD2与复合物LPS/LBP/CD14 相互作用，激活胞内包括NF-κB等信号传导通路，最终引起NF-κB活化和AP-1磷酸化，诱导炎性反应及其细胞因子表达。故认为LPS信号传导通路与多种炎症性疾病发生发展关系密切[1]。TLR4和CD14基因位于染色体的不同位置，TLR4位于染色体9q32-33上，CD14基因位于5q上，TLR4和CD14基因的变异对不同个体的内毒素和LPS的反应性可能有重要的影响[2，3]。但是否与结核病有关系尚未清楚。因此，本课题选择百色地区原住壮族人群作为研究对象，所有原住壮族人群三代内均未与其他民族通婚，而且离开本地连续时间未超过6个月，选择从2011年1月到2017年12月共180例患者，其中，脊柱结核患者60人、肺结核患者60人和健康对照者60人。采用DNA测序法对三组人群CD14基因序列及包含TLR4基因 12874位点 T/C的突变(Asp299Gly) 基因序列、13174位点 G/A突变 (Thr399Ile)的基因序列进行测序，研究百色地区原住壮族人群有无基因多态位点及其分布特征，并比较三组人群的基因分布特点。

1 资料与方法

1.1资料 选取2011年1月～2017年12月在右江民族医学院附属医院体检健康人群60例、住院肺结核患者60例和脊柱结核患者 60例。健康人群60例(对照组)中，男29例，女31例，年龄22～50岁，平均(39.86 ±3.12)岁。脊柱结核组 60例中，男38例，女22例;年龄21～56岁，平均(42.42 ±2.02)岁。肺结核组 60例中，男28例，女32例;年龄18～52岁，平均(41.98 ±2.17)岁。三组性别和年龄比较差异均无显著性(P>0.05)，具有可比性。所有三组壮族人群三代内均未与其他民族通婚，而且离开本地连续时间未超过6个月。

1.2实验方法

1.2.1标本采集 住院当日或门诊体验当日采取静脉血2 ml，放置1 h后以1 500 r/min离心1 min，取上清，放置于-70℃冰箱冻存备用，利用全自动生化检测仪-迈瑞BS-2000M免疫荧光法常规测定血清总IgE和sIgE；同时另外采取静脉血2 ml，加入抗凝剂EDTA后置于-70℃冰箱冻存备用，准备提取DNA(利用chelex-100快速提取法提取DNA模板)。

1.2.2CD14及TLR4引物设计 根据NCBIGenBank数据库和Primer3程序对TLR4基因序列进行引物设计，引物包含TLR4基因序列AF177765，通过对包含TLR4基因12874位点T/C突变(Asp299Gly)、13174位点G/A突变(Thr399 Ile)的基因序列进行引物设计。引物1(包含A12874G)为5′-GGTTTAGAAGTCCATCGTTT-3′和5′-GGAAGTGAAAGTAAGCCTTT-3；引物2 (包含C13174T)为5 ′-CCACATTGAAACTCAAATCT-3和5-TGAGGTT-TCTGAGTGATAGG-3′。同理对CD14进行引物设计，通过对包含CD14基因序列AC116353和包含CD14基因转录起始点前720位至起始点后2650位的基因序列进行引物设计，见表1。

1.2.3PCR扩增、产物分析及纯化测序反应 制备反应体系总体积为30 μl，其中，去离子水 18 μl，10×buffer 和Mg2+各3 μl，Taq 聚合酶 2 μl，上下游引物模板DNA 各1 μl，dNTP 1 μl。扩增热循环过程条件：95℃ 预变性3 min，94℃变性1 min，55℃复性30 s，72℃延伸1 min，共计35个循环，最后72℃延伸10 min，4℃保存。取3 μl PCR反应产物加至凝胶孔，5 V/cm 电泳;用手提式长波紫外灯随时检查电泳状况，当DNA Ladder最前泳带或指示剂离阳极端适当位置时结束电泳。 转至紫外透射分析仪观察结果。分别利用MultiScreen96试剂盒对PCR产物进行纯化和MegaBACE1000全自动毛细管测序仪对PCR产物进行测序。

表1 CD14序列测定引物表
Tab.1 CD14 sequence determination of primer table

PrimerSequence(5′-3′)Length(bp)DirectionSize(bp)Tm(℃)CD14X2F1GTTGATTTGGTTCTGTTCC19F46852.43CD14X2R1TCACGAAATCGAAGAAAGGA19R53.12CD14X2F2ACTGTAGGGTCCTAATGTAT20F45553.68CD14X2R2GAAATCTTTGCCGAGATCCT20R53.41CD14X2R3GAGGATCTGGAGACGAGAGA18F47552.89CD14X2R3TTCGACCTTTCACGTTCA18R53.42CD14X2F4AGCTCCTGGATTTCTATTGG20F47953.49CD14X2R4CTGTCTAACTCCCTCAAGT20R53.31CD14X2F5GATCTGGAGTCGGTGTTGA19F41052.68CD14X2R5CGTCAAACTCAGGTAAGTA19R53.42CD14X2F6CTCCACCTATTGGACTGTGA20F1253.97CD14X2R6TCCCTCAATCCTACTTCTTT20R53.72

1.3统计学处理 利用统计分析软件 SPSS18.0进行统计学分析，用频率计数法计算脊柱结核组、肺结核组和健康组TLR4基因12874位点A/G突变(Asp299Gly)、13174位点C/T突变(Thr399Ile)多态性和CD14位点基因型以及等位基因频率，然后经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验。不同组别各等位基因及基因型频率用χ2检验。P<0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1TLR4基因分析 60例脊柱结核患者、肺结核患者和60例健康对照组均未发现TLR4基因12874位点A/G的突变 (ASp299Gly)和13174位点C/T突变(Thr399Ile)，见图 1，提示百色地区原住壮族人群上述两位点的突变并不常见。

2.2CD14基因分型 采用基因序列测定及分析，百色地区原住壮族人群存在CD14/-159多态性，未发现其他多态位点。 CD14/-159不同基因型测序图见图2。

2.3CD14基因频率分析 脊柱结核组、肺结核组和健康对照组的基因型频率和等位基因频率见表2，按Hardy-Weinberg平衡吻合度检验，脊柱结核组、肺结核组和健康对照组三组含有T等位基因携带者的基因型频率和等位基因频率分布,差异有显著统计学意义(P<0.05)。

图1 TLR4基因12874位点A/T 、13174位点C/T多态性凝胶电泳图(8%聚丙稀酰胺)Fig.1 Gel electrophoresis of polymorphism of TLR4 gene loci 12874 A/T and loci 13174 C/T (8% polypropylene amide)Note: M.PCR marker;2,4,5,6.A/T genotype;1,3,7,8.C/T genotype.

图2 CD14/-159基因型测序图(2、3和4分别显示AA、AT和TT基因型)Fig.2 CD14/-159 gene sequencing diagram (2,3 and 4 respectively show AA,AT and TT genotype)

表2 三组CD14/-159 基因型频率和等位基因频率比较
Tab.2 Comparison of CD14/-159 genotype frequency and allele frequency in each groups

GroupsCaseGenotypefrequency(%)TCTTCCAllelefrequency(%)TCControlgroup6025.063.311.770.929.1Pulmonarytuberculosisgroup6035.051.713.364.635.4Spinaltuberculosisgroup6040.043.311.766.332.2χ25.4328.4621.9187.3212.016P0.0250.0040.4620.0210.059

3 讨论

3.1Toll样受体4基因多态性 研究表明TLR4基因至少有两种基因多态性[4]；而且TLR4基因多态性与多种感染性疾病发生发展关系密切[5]；Azzam等[6]研究发现TLR4基因多态性与溃疡性结肠有关；Skevaki等[7]认为TLR4基因多态性与感染性疾病有关；Lorenz[8]和Winters等[9]研究提示TLR4基因多态性与新生儿早产有关。

本研究利用DNA测序法对百色地区180例原住壮族人群进行TLR4位点Asp299Gly和Thr399Ile的基因多态性检测，未明确发现Asp299Gly和Thr399Ile位点基因突变，此研究结果与孙钰锋等[10]国内学者及Feng等[11]国外学者的研究结果基本相似。由此推测，相对于西方白种人而言，百色地区原住壮族人群的TLR4基因多态性“Asp299Gly”和“Thr399Ile”携带者的比例可能较低。

3.2CD14基因多态性 据研究表明，CD14基因有多个多肽位点的基因，CD14基因多态性主要表现在启动子-159位碱基C和碱基T的转换；另有报道CD14/-260位点也有多态性，但不同的研究工作者对起始密码子位点计数的差异导致启动子多态性位点尚未有定论。如蔺静等[12]对118例健康献血员进行了 CD14/-159位点基因型检测，等位基因T和C的频率分别为60.2%和39.8%，有40例为T等位基因纯合子(TT)， 62例为杂合子(TC)，C等位基因纯合子有16例(CC)。湖北健康儿童CD14/-159位CC、CT、TT基因型频率分别是13.9%、58.3%和27.8%[13]。还有胡海芳[14]、冯凯等[15]对新疆和重庆等地的汉族健康献血员的CD14/-159基因多态性研究结果提示其他地区汉族CD14/-159基因多态性分布相当广泛，而且T等位基因和TT基因型频率远高于国外人群，在日本、捷克等其他国家也有报道存在 CD14/-159 C/T多态性。本研究对180例百色地区原住壮族人群的CD14启动子进行了基因测序，包含CD14转录起始点前720位至启动子后2650位的基因序列，结果提示启动子区-159位存在C/T的基因多态性，但没有发现其他多态位点，而且百色地区原住壮族人群CD14/-159基因多态性以碱基TT为主，脊柱结核组和肺结核组的碱基T等位基因频率分别占70.9%和64.6%，经检验符合Hardy-Weinberg平衡，可以代表百色地区原住壮族人群的样本状况。本研究结果与重庆地区汉族人群献血员检测结果基本一致；由此可见， CD14/-159 C/T多态性在不同种族人群普遍存在，但国外报道多以TC基因型为主，提示不同种族人群可能存在不同的基因型。上述研究均提示TC基因型是当地人群的主要基因型。是否不同地区人群确实存在基因学的差异，抑或是实验方法的差异导致上述不同，可能还需进行进一步的研究证实。

3.3CD14/-159多态性和脊柱结核 肺结核易感基因主要分为人类白细胞抗原基因(human leukocyte antigen,HLA)和非白细胞抗原基因(非HLA)。后者主要有：维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)、Toll样受体(toll-like receptors,TLR)、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、自然抗性相关性巨噬细胞蛋白1基因(natural resistance associated macrophage protein 1,NRAMP1)等，目前Lee等[16]研究提示VDR的Fok Ⅰ 基因的携带者患结核病风险比不携带者高1.34倍；在TLRs基因研究23个基因位点后发现TLR1的rs5743618G/T基因位点和TLR8 rs3764879C/G、rs3764880A/G两个基因位点与肺结核易感相关[17]；国内杨秉芬等[18]在研究活动性肺结核患者中，NK细胞表面高表达CD244与非结核患者无显著差异，还有张宪波等[19]研究CD44在肺结核患者体内的表达水平明显高于对照组且有显著差异。本研究结果显示壮族人群的TLR4的两个基因位点Asp299Gly和Thr399Ile也与肺结核无明显差异，与Dittrich等[20]研究有类似结论。

相对于脊柱结核，肺结核易感基因多态性研究比较多且结论不尽相同。在脊柱结核易感基因研究中，CD14是内毒素(LSP)介导的信号传导通路中细胞反应的重要受体，CD14在脊柱结核也是重点研究的易感基因。在通常细菌感染的炎症反应中，CD14受体剌激Th1细胞因子表达，基因多态CD14存在使Th2表型持续继而发生脊柱结核传染。既往研究表明CD14基因多态性与骨关节结核易感转移有比较多的争议[21,22]。本研究表明，相对于肺结核组和健康组，脊柱结核组CD14的基因型频率及基因频率差异无统计学意义(P>0.05)，提示百色地区原住壮族人群存在CD14基因多态性，但该多态位点与脊柱结核的易感性无明显相关性。王冰洁等[23]对CD14/-159基因多态性进行研究并对其多态性及其启动因子进行研究，提示CD14/-159及其启动因子可能与基因环境相互作用，从而影响疾病的发生发展。肺结核与脊柱结核基因多态性的研究可能存在相近的易感基因或者完全不同的易感基因，因此有必要研究不同水平LPS暴露和其他多态位点对CD14的影响以及CD14基因多态性与脊柱结核发病的关系。