PD-1/PD-L1在复发性流产患者外周血T淋巴细胞中的表达及意义

朱一喜 何树光 陈超英 唐玲丽 (中南大学湘雅二医院检验科，长沙 412000)

复发性流产是于孕早期出现2次及以上自然流产，且多发生于同一妊娠月份，严重影响患者身心健康，需采取针对性治疗措施改善患者妊娠结局，提高分娩率[1]。研究表明，因胎儿基因受父系及母系两者所决定，而妊娠作为半同种移植过程，一般需要通过有效免疫调控维持免疫平衡，避免因母体免疫系统排斥导致流产，因此免疫失衡在复发性流产起重要作用，其中淋巴细胞免疫治疗作为临床常用治疗方法，可改善患者免疫失衡，疗效获得认可[2]。程序性死亡因子1(programmed death factor-1，PD-1)及程序性死亡因子配体1(programmed death factor-ligand 1，PD-L1)为当前免疫治疗关注热点，并在T淋巴细胞介导的细胞免疫中具有重要作用[3]。此外，有研究显示PD-1/PD-L1在肾癌、肺癌、膀胱癌等恶性肿瘤存在异常表达，还可能参与母体免疫耐受诱导及维持妊娠过程[4]。但当前国内外关于PD-1/PD-L1与复发性流产相关性鲜有报道，且多集中于动物模型及体外细胞实验，基于此，本研究对比健康人群与复发性流产患者PD-1/PD-L1在外周血T淋巴细胞中表达水平，并探究其可能作用机制，为临床治疗提供理论依据，现报告如下。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1一般资料 选取2015年7月～2017年2月本院收治的复发性流产患者57例为观察组，年龄23～38岁，平均(29.04±3.58)岁；流产次数2～6次，平均(3.18±0.52)次。纳入标准：①所有患者经病史询问及系统检查均符合美国生殖医学学会制定的复发性流产诊断标准[5]；②夫妇双方染色体正常；③处于非妊娠期，距上次流产3个月以上；④封闭抗体阴性；⑤丈夫精液分泌正常，且性功能无障碍；⑥本研究经伦理委员会批准；⑦患者知晓本研究并自愿参加。排除标准：①生殖道器质性病变；②存在生殖道感染及内分泌病史；③自身免疫性疾病、心肝肾等严重疾病；④凝血功能障碍；⑤近期接受影响PD-1/PD-L1水平药物；⑥中途退出研究者。另选取42例正常妊娠妇女为对照组，年龄22～37岁，平均(29.52±3.17)岁，孕周<12周，经B超检查为宫内妊娠且有胎心搏动，无既往流产、死胎、死产史。两组年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)并具有可比性。

1.1.2仪器与试剂 选用美国贝克曼CytoFLEX 流式细胞仪及其相应配套溶血剂，并采用法国IMMUNOTECHS.A.S公司生产的单克隆荧光抗体CD3-APC、CD4-PerCP、CD8-FITC、PD-1-PE及PD-L1-PE。

1.2方法

1.2.1样本制备 抽取所有受试者(患者于治疗前抽取)空腹外周静脉血3 ml，EDTA-K2抗凝，1支流式管加入5 μl CD3-APC+5 μl CD4-PerCP+5 μl CD8-FITC+50 μl全血，1支流式管加入5 μl CD3-APC+5 μl CD4-PerCP+5 μl CD8-FITC+5 μl PD-1-PE+50 μl全血，1支流式管加入5 μl CD3-APC+5 μl CD4-PerCP+5 μl CD8-FITC+5 μl PD-L1-PE+50 μl全血。将试剂轻微混匀后于室温避光孵育30 min，随后加入相应溶血剂于室温避光孵育12 min，待完全溶血后，离心洗涤，再加入500 μl鞘液重悬细胞并上机检测，结果以阳性率(%)表示。

1.2.2患者淋巴细胞免疫治疗方案 所有患者丈夫经血脂、肝功能、生化等项目检查，确保指标正常并可提供血源治疗，若任意一项检查未符合标准可筛选健康无关个体提供淋巴细胞来源。确定来源后，空腹抽取患者丈夫及健康无关个体静脉血30 ml，与等量生理盐水混匀并离心收集淋巴细胞，并调节细胞数至2×1010～3×1010L-1。在左手前臂内侧分3点皮内注射，患者每2周接受1次治疗，共进行4次治疗。最后于治疗结束后2周接受PD-1/PD-L1检测并安排受孕，经检测确认妊娠后继续接受淋巴细胞免疫治疗，治疗至妊娠20周。

1.2.3妊娠成功标准 对患者进行随访调查，妊娠超过28周，经超声检查未见异常并分娩活婴。

2 结果

2.1对比两组外周血T淋巴细胞比例 观察组CD3+、CD8+显著低于对照组，CD4+、CD4+/CD8+显著高于对照组(P<0.05)，详见表1。

2.2对比两组PD-1/PD-L1在T淋巴细胞表达水平 观察组PD-1/CD4+、PD-1/CD8+、PD-L1/CD4+、PD-L1/CD8+显著低于对照组(P<0.05)，详见表2。

GroupsPD-1/CD4+PD-1/CD8+PD-L1/CD4+PD-L1/CD8+Observationgroup(n=57)15.02±2.418.94±1.9523.14±3.499.16±1.78Controlgroup(n=42)17.36±2.6912.37±2.6426.28±4.5113.84±1.95t4.5447.4393.90612.415P0.0000.0000.0000.000

GroupsPD-1/CD4+PD-1/CD8+PD-L1/CD4+PD-L1/CD8+Beforetreatment15.02±2.418.94±1.9523.14±3.499.16±1.78Fourweeksaftertreatment16.14±2.171)10.37±2.461)24.72±3.671)10.04±1.851)Eightweeksaftertreatment17.52±2.361)12.58±2.781)26.59±4.361)11.96±2.031)

Note：Compared with before treatment，1)P<0.05.

Note：Compared with before treatment，1)P<0.05.

2.3患者治疗前后PD-1/PD-L1在T淋巴细胞表达水平 患者治疗后4周、治疗后8周PD-1/CD4+、PD-1/CD8+、PD-L1/CD4+、PD-L1/CD8+均显著高于治疗前(P<0.05)，详见表3。

2.4对比患者不同妊娠结局PD-1/PD-L1在T淋巴细胞表达水平 57例患者接受淋巴细胞免疫治疗后，妊娠成功43例，妊娠失败14例。妊娠成功组PD-1/CD4+、PD-1/CD8+、PD-L1/CD4+、PD-L1/CD8+均显著高于治疗前，且显著高于妊娠失败组(P<0.05)，详见表4。

3 讨论

复发性流产作为临床较难治疗的不孕症，发病率约为5%，流产前兆多表现为腰酸、乳房胀痛、小腹隐痛等临床症状，对患者身体健康造成严重威胁，也影响家庭关系。复发性流产发病机制至今尚未明确，其原因较为复杂，国内外研究显示，免疫、感染、遗传、环境等因素均可导致复发性流产发生[6,7]。有临床研究表明，为维持母体正常妊娠需依赖于封闭抗体，封闭抗体主要经胚胎人类Ⅱ类抗原以及滋养淋巴细胞交叉抗原产生，并与母体淋巴抗原或胎盘中滋养细胞抗原相结合，从而防止其被母体免疫系统识别杀伤，避免有害免疫应答发生，最终达到维持正常妊娠目的[8-10]。因此，复发性流产发生多因母体封闭抗体不足导致胚胎滋养细胞受免疫攻击而流产。国内学者研究显示，血清中可溶性程序性死亡分子1及其配体可溶性程序性死亡分子L1异常增高，不利于妊娠，从而引起流产[11]。对此，本研究检测PD-1/PD-L1在患者T淋巴细胞上表达水平，探究其可能作用机制。

T淋巴细胞作为重要免疫细胞之一，CD4+T细胞和CD8+T细胞为其主要亚群，可反映封闭抗体效率，并影响孕期母胎耐受形成，而效应T细胞活化异常以及调节性T细胞(regulatory T，Treg)抑制作用降低将导致复发性流产[12-14]。因此，临床需采用有效治疗手段改善母体免疫失衡状态。近期临床研究显示，PD-1与其配体PD-L1在母胎免疫耐受方面具有重要作用[15]。PD-1作为负性协同刺激分子，可在树状突细胞、CD8+T细胞、单核细胞等造血细胞中诱导性表达[16]。PD-1的配体有PD-L1、PD-L2两种，其中PD-L1的分布范围较PD-L2更广，也是临床研究主要配体，其不仅同PD-1在巨噬细胞、T细胞等造血细胞中大量表达，经活化后水平呈上升趋势，并且在星形胶质细胞、血管内皮细胞以及上皮细胞等非造血细胞中大量表达[17]。PD-1与PD-L1主要在T细胞免疫应答及免疫稳态中扮演重要角色，两者相结合后在机体免疫应答中通过免疫受体酪氨酸抑制基序传入抑制信号起负性调控作用，抑制细胞增殖与活化，并抑制细胞存活，同时对Treg细胞产生及分化起促进作用，并增强Treg细胞功能[18,19]。

本研究结果显示，观察组CD3+、CD8+显著低于对照组，CD4+、CD4+/CD8+显著高于对照组，可见复发性流产患者处于免疫失衡状态，其中CD8+T细胞所分泌的细胞因子、溶血细胞活性与子宫胎盘发育存在密切联系，从而可能影响胎儿的生长发育，引发流产。段忠亮等[20]在研究中检测显示，患者外周血T细胞中PD-1比例明显降低，其可作为治疗潜在靶点。本研究采用流式细胞仪检测PD-1及其配体PD-L1在T淋巴细胞当中表达水平，结果显示，观察组PD-1/CD4+、PD-1/CD8+、PD-L1/CD4+、PD-L1/CD8+显著低于对照组，可见PD-1/PD-L1在T淋巴细胞中呈低水平表达，推测PD-1/PD-L1信号通路在建立及维持母体免疫耐受过程中发挥重要调控作用，与段忠亮研究结果相一致。可能为适应胚胎植入，母胎界面微环境及免疫系统发生适应性改变以维持母胎免疫耐受，并且免疫细胞间、非免疫细胞与免疫细胞间相互作用影响胎盘形成、母胎免疫耐受，因PD-1多在T淋巴细胞、巨噬细胞表达，PD-L1则主要在专职抗原提呈细胞中广泛表达，从而在诱导母体免疫耐受中发挥重要作用[21]。但针对其具体作用机制仍需深入研究，进而有效预防病理性妊娠疾病发生，改善妊娠结局。患者治疗后4周、治疗后8周PD-1/CD4+、PD-1/CD8+、PD-L1/CD4+、PD-L1/CD8+均显著高于治疗前。本研究结果同伍金华[22]研究显示患者经淋巴细胞免疫治疗后CD3+PD-1+T细胞水平明显提高相似，也充分证明淋巴细胞免疫治疗方式有效性，改善机体免疫功能，提高妊娠率。推测因患者接受淋巴免疫治疗后，PD-1及配体PD-L1水平上升促使封闭抗体产生，从而保护胎儿，维持母体免疫耐受。对所有患者进行随访调查，结果显示，妊娠成功43例，妊娠失败14例，妊娠成功组PD-1/CD4+、PD-1/CD8+、PD-L1/CD4+、PD-L1/CD8+均显著高于治疗前，且显著高于妊娠失败组，表明通过治疗PD-1与PD-L1数量有所提高，其可作为观察淋巴细胞免疫治疗效果的有效检测指标，也为临床治疗复发性流产开辟新思路。

综上所述，PD-1/PD-L1在复发性流产患者外周血T淋巴细胞中表达水平明显降低，在复发性流产发展过程中具有重要意义，患者接受淋巴细胞免疫治疗后PD-1/PD-L1表达水平显著上升，但妊娠失败者PD-1/PD-L1水平仍处于较低水平，PD-1及其配体PD-L1可作为临床治疗该疾病的潜在靶点。但因本研究整体纳入对象较少，未明确PD-1/PD-L1信号通路在母胎界面作用效应，本结论可能存在偏倚，应在大量临床样本研究基础上进一步探究PD-1/PD-L1在复发性流产中的具体作用机制，为临床治疗提供准确理论依据，从而利于母婴健康及人类繁殖。