脑梗死大鼠脑组织生长分化因子-15的表达及其与神经功能损害的关系①

焦光美 单海雷 康玲伶 张晓璇 马 征 窦志杰 赵 亮 冯亚茹 杨 宁

(承德医学院附属医院神经内科，承德 067000)

脑梗死是常见的脑血管疾病，是由于脑供血不足引起的脑组织缺血性坏死，脑梗死在中老年人群中高发，随着我国人口的不断老龄化，脑梗死的发生率有不断上升趋势；以动脉粥样硬化为基础的脑梗死是最常见的病理类型[1]，血管壁炎症反应在动脉粥样硬化的各个阶段具有重要作用，与动脉粥样硬化相关的炎症因子越来越受到重视，GDF-15与发转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员之一，是一种应激蛋白，在心脑血管疾病、炎症、肿瘤等情况下GDF-15水平升高[2]，研究发现GDF-15与心肌梗死等心血管疾病关系密切[3,4]，关于GDF-15与脑梗死的研究较少，有研究发现血清GDF-15与急性缺血性脑卒中关系密切，而GDF-15在脑梗死组织中的表达及其在脑梗死发生中的机制尚不十分清楚。本文通过建立脑梗死大鼠模型，研究脑梗死大鼠脑组织中GDF-15表达情况及意义。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 清洁级健康SD大鼠45只，雄性，体重230～250 g，购自北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司，许可证号：SYXK(京)2014-0017。

1.1.2主要试剂 伊红、苏木素等(国药集团化学试剂有限公司)，GDF-15单克隆抗体、Smad2单克隆抗体、Smad4单克隆抗体、p21单克隆抗体、GAPDH抗体、HRP标记的山羊抗兔抗体、BCA试剂盒(美国Gibco公司)。

1.2方法

1.2.1动物分组及建模 45只大鼠根据随机数字法分为脑梗死组、假手术组和正常对照组，每组15只，脑梗死组大鼠采用线栓法制作脑梗死动物模型：大鼠麻醉后仰卧固定于动物手术台上，暴露颈部皮肤，消毒后剪开颈部皮肤，分离大鼠颈总动脉、颈内动脉以及颈外动脉，颈外动脉远心端结扎，颈内动脉远心端和颈总动脉近心端放置动脉夹，剪断颈外动脉结扎处，插入栓线至颈内动脉处，将颈内动脉夹打开继续推进栓线至遇到阻力为止，阻断大脑中动脉血流，固定栓线、缝合皮肤，2 h后拔出栓线。假手术组大鼠暴露颈内动脉后直接缝合皮肤。正常对照组不予处理。大鼠建模后表现为右侧转圈障碍、右前爪不能伸展，表明脑梗死模型建立成功。建模后脑梗组大鼠死亡2只，存活13只；假手术组和正常对照组大鼠无异常表现，两组15只均存活。

1.2.2大鼠神经功能mNSS评分 建模后1周，对各组大鼠进行感觉、运动、反射活动、平衡木四个方面的神经功能mNSS评分测定，mNSS评分为0～18分，分值越高表明神经功能损伤越严重。

1.2.3大鼠脑组织采集 各组大鼠神经功能mNSS评分测定后，麻醉各大鼠，麻醉成功后，将大鼠固定到手术台上，断头取各大鼠脑组织进行HE染色、Western blot和RT-PCR测定。

1.2.4大鼠脑组织HE染色 将各大鼠脑组织进行常规石蜡包埋，切成厚4 μm厚切片，经甲醛固定，常规进行HE染色，显微镜下观察各大鼠脑组织病理学变化，并进行TTC染色测量脑梗死面积。每只大鼠取5个视野计算脑梗死面积，脑梗死面积以脑梗死面积/脑组织总面积×100%表示。

1.2.5大鼠脑组织中GDF-15、Smad2、Smad4、p21蛋白水平测定 将各组大鼠脑组织放入EP管中，加入蛋白裂解液研磨均匀，反应30 min，13 000 r/min离心15 min，留取上清液，采用BCA法测定蛋白浓度，采用Western blot法测定大鼠脑组织中GDF-15、Smad2、Smad4、p21蛋白水平，以GDF-15单克隆抗体、Smad2单克隆抗体、Smad4单克隆抗体为一抗、p21单克隆抗体为一抗，以GAPDH为内参照，以羊抗鼠抗体作为二抗进行Western blot测定。GDF-15、Smad2、Smad4p21蛋白的相对表达量=GDF-15、Smad2、Smad4p21蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值。

1.2.6大鼠脑组织中GDF-15、Smad2、Smad4、p21 mRNA水平测定 将各组大鼠脑组织标本研磨成粉末，再加入Trizol研磨，收集悬液，提取脑组织总RNA，采用RT-PCR测定脑组织中GDF-15(上游引物：5′-AGGTGTGTTGAGAGGATGAGAGATATTAG-3′，下游引物：5′-AAAACAATCATCCTTATCC-AAAACCT-3′)、Smad2(上游引物：5′-CCATCCCCGACAAGACTAACTT-3′，下游引物：5′-TGGTGGTCGATAGTTTGTCCAT-3′)、Smad4(上游引物：5′-ACCAACTTCCCTAACTTTCCT-3′,下游引物：5，-ACTATGGCTCGGTGCGAGAA-3′)、p21(上游引物：5′-GAGAACTCGGGACCGCTTTC-3′，下游引物：5′-TCCTGAGCGTGTTTGCTGTC-3′) mRNA水平，PCR反应条件为：95℃ 5 min；95℃ 10 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s，共42个循环；72℃ 5 min。GDF-15、Smad2、Smad4、p21 mRNA相对表达量采用2-ΔΔCt表示。

2 结果

2.1各组大鼠脑组织HE染色 脑梗死组大鼠脑组织水肿，脑细胞排列紊乱，细胞核仁模糊，小胶质细胞数量增多，脑梗死面积为20.13%；假手术组和正常对照组大鼠脑组织未见明显异常。见图1。

图1 各组大鼠脑组织HE染色(×100)Fig.1 Morphology of brain tissue of rats in various groups (HE,×100)Note:A.Cerebral infarction group;B.Sham operation group;C.Normal control group.

2.2各组大鼠mNSS评分比较 脑梗死组大鼠建模后表现为右侧转圈障碍、右前爪不能伸展，表明脑梗死模型建立成功，死亡2只，存活13只；假手术组和正常对照组大鼠无异常表现，每组15只均存活。三组大鼠mNSS评分比较差异有统计学意义(F=397.354，P<0.001)，其中脑梗死组大鼠mNSS评分[(11.43±2.14)分]明显高于假手术组[(0.45±0.07)分]和正常对照组[(0.43±0.09)分](P<0.05)，假手术组和正常对照组大鼠mNSS评分比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3各组大鼠脑组织GDF-15、Smad2、Smad4、p21蛋白水平比较 脑梗死组大鼠脑组织GDF-15、Smad2、Smad4蛋白水平高于假手术组和正常对照组(P<0.05)，p21蛋白水平低于假手术组和正常对照组(P<0.05)，假手术组和正常对照组大鼠脑组织GDF-15、Smad2、Smad4、p21蛋白水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、图2。

2.4各组大鼠脑组织GDF-15、Smad2、Smad4、p21 mRNA水平比较 脑梗死组大鼠脑组织GDF-15、Smad2、Smad4 mRNA水平高于假手术组和正常对照组(P<0.05)，p21 mRNA水平低于假手术组和正常对照组(P<0.05)，假手术组和正常对照组大鼠脑组织GDF-15、Smad2、Smad4、p21 mRNA水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 各组大鼠脑组织GDF-15、Smad2、Smad4、p21蛋白水平比较

Tab.1 Levels of GDF-15,Smad2,Smad4 and p21 in brain tissue in various group rats

GroupsnProtein relative expressionGDF-15Smad2Smad4p21Cerebral infarction group130.54±0.230.63±0.210.77±0.260.23±0.06Sham operation group150.11±0.051)0.25±0.131)0.31±0.171)0.57±0.211)Normal control group150.12±0.041)0.23±0.121)0.32±0.151)0.55±0.191)F value 47.35628.58224.54216.993P value<0.001<0.001<0.001<0.001

Note：In comparison with cerebral infarction group,1)P<0.05.

表2 各组大鼠脑组织GDF-15、Smad2、Smad4、p21 mRNA水平比较

Tab.2 mRNA levels of GDF-15,Smad2,Smad4 and p21 in brain tissue in various group rats

GroupsnGDF-15 mRNASmad2 mRNASmad4 mRNAp21 mRNACerebral infarction group130.73±0.181.54±0.361.42±0.410.63±0.11Sham operation group150.09±0.030.67±0.180.74±0.191.21±0.14Normal control group150.11±0.040.65±0.170.71±0.221.19±0.16F value170.02358.23027.421201.734P value<0.001<0.001<0.001<0.001

图2 大鼠脑组织GDF-15、Smad2、Smad4、p21蛋白Western blot电泳图Fig.2 Western blot results of GDF-15,Smad2,Smad4 and p21 in brain tissue of ratsNote:A.Cerebral infarction group;B.Sham operation group;C.Normal control group.

表3 脑梗死大鼠脑组织GDF-15蛋白水平与mNSS评分及Smad2、Smad4、p21蛋白水平的相关性

Tab.3 Correlation between GDF-15 level in brain tissue in cerebral infarction group rats,mNSS scores and levels of Smad2,Smad4 and p21

IndexGDF-15 proteinr valueP valuemNSS scores0.546<0.001Smad2 protein0.613<0.001Smad4 protein0.576<0.001p21 protein-0.523<0.001

表4 脑梗死大鼠脑组织GDF-15 mRNA水平与mNSS评分及Smad2、Smad4、p21 mRNA水平的相关性

Tab.4 Correlation between GDF-15 mRNA level in brain tissue in cerebral infarction group rats,mNSS scores and mRNA levels of Smad2,Smad4 and p21

IndexGDF-15 mRNAr valueP valuemNSS scores0.572<0.001Smad2 mRNA0.645<0.001Smad4 mRNA0.607<0.001p21 mRNA-0.512<0.001

2.5脑梗死大鼠脑组织GDF-15水平与mNSS评分及Smad2、Smad4、p21水平的相关性 脑梗死大鼠脑组织GDF-15蛋白水平与mNSS评分、Smad2蛋白、Smad4蛋白水平呈正相关(P<0.05)，与p21蛋白呈负相关(P<0.05)，脑组织GDF-15 mRNA水平与mNSS评分、Smad2 mRNA、Smad4 mRNA水平呈正相关(P<0.05)，与p21 mRNA呈负相关(P<0.05)。见表3、4。

3 讨论

GDF-15是从人骨髓单核细胞系中分离出来的，其蛋白结构符合TGF-β超家族成员结构，因此GDF-15为TGF-β超家族成员之一，在生理情况下，GDF-15只有在前列腺、胎盘等少数组织中表达，在其他组织中不表达或表达量非常少[5,6]；GDF-15为一种应激蛋白，在肿瘤、心血管疾病、炎症、外伤等各种应激状态下，GDF-15表达量明显增加[7]。GDF-15在心血管疾病中的研究比较多，血循环中GDF-15水平升高为多种心血管疾病(包括稳定性冠心病、急性冠状动脉综合征、心力衰竭等)发生心血管事件的高危因素[8-10]。GDF-15在脑血管疾病中的研究不多，卢昌均等[11]研究发现血清GDF-15水平与急性缺血性脑卒中关系密切；Andersson等[12]研究发现循环中GDF-15水平与脑损伤和脑中风关系密切。本文通过建立脑梗死大鼠模型，研究脑梗死大鼠脑组织中GDF-15表达情况，发现与假手术组和正常对照组大鼠比较，脑梗死大鼠脑子中GDF-15水平升高，GDF-15水平与神经功能缺损呈正相关，考虑GDF-15与脑梗死的发生关系密切。

Smad蛋白家族直接参与TGF-β超家族成员的信号传导，是细胞内重要的信号转导蛋白之一，Smad蛋白家族参与细胞分化、增殖、迁移、凋亡等多种细胞活动，在维持细胞内环境稳态中具有重要作用[13，14]；在机体受到损伤时，细胞释放TGF-β，TGF-β与细胞表面受体结合正反馈引起其他TGF-β受体磷酸化，磷酸化的TGF-β受体激活Smad信号通路，并使细胞内的Smad2和Smad3磷酸化，并发生空间构象变化[15，16]，并与Smad4发生交联，形成异三聚体复合物，异三聚体复合物进入细胞核，调控靶基因转录，从而促进炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等[17，18]。p21是受Smad4调控的靶基因，p21水平降低可促进细胞衰老和死亡，与细胞凋亡关系密切[19]。本文对GDF-15与Smad2、Smad4进行相关性研究，发现脑梗死大鼠脑组织Smad2、Smad4水平升高，p21水平降低，脑组织GDF-15水平与Smad2、Smad4水平呈正相关，与p21水平呈负相关，因此，考虑GDF-15对脑梗死神经功能的影响可能与Smad通路及其靶基因p21有关。