荜茇酰胺逆转人小细胞肺癌H446/DDP细胞耐药性及机制的研究①

肖 娟 张华果 陈 洁 牛朝霞 杨红梅

(河南医学高等专科学校，郑州 451191)

肺癌是对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，肺癌的发病率和死亡率一直位居恶性肿瘤谱第一位[1]。小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)约占肺癌发生率的20%，由于恶性程度高、侵袭性强、易转移、多数SCLC患者在确诊时已为晚期，失去了手术治疗的最佳时机，因此放疗和化疗成为主要的治疗手段。尽管大多数SCLC患者对初始化疗较敏感，但极易产生化疗耐药性，导致治疗失败[2]。因此，逆转化疗耐药性成为目前SCLC治疗中亟待解决的问题之一。荜茇酰胺(piperlongu-mine,PLM)，又名荜茇明碱，是分离自荜茇的一种生物碱类化合物。近年研究表明，PLM对前列腺癌、结肠癌、肺腺癌、肝癌和黑色素瘤等恶性肿瘤具有显著的抑制作用[3-7]。Wang等[8]研究证实，PLM可逆转人视网膜母细胞瘤耐药株对长春新碱和卡铂的耐药性。但目前国内外尚未见PLM对SCLC顺铂(cisplatin,DDP)耐药性逆转作用的报道。本研究拟通过分子生物学方法探究PLM对人SCLC耐药株H446/DDP细胞的逆转作用及其分子机制。本研究有望为PLM治疗SCLC奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料 人小细胞肺癌H446细胞购自中国科学院昆明细胞库；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和RPMI1640培养基购自Hyclone公司；PLM和DDP购自美国Selleck公司；CCK-8试剂盒购自武汉博士德生物公司；AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒、RIPA裂解液和ECL化学发光试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；兔抗人P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance associated protein 1,MRP1)、谷胱甘肽S转移酶P1(glutathione S transferase P1,GSTP1)、Survivin、细胞周期蛋白A(cyclin A)、细胞周期依赖性蛋白激酶2(cyclin dependent kinase 1,CDK1)和β-actin单克隆抗体购自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 A549细胞用含10%FBS的RPMI1640培养液培养，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱内；每2 d换液1次，待细胞覆盖率达到80%时进行传代。

1.2.2建立耐药株H446/DDP细胞 取对数生长期的H446细胞，加入含0.1 mg/L DDP的培养液，培养48 h后，更换为不含DDP的培养液继续培养，待细胞恢复生长后重复上述处理，若细胞能在该浓度下稳定生长，则逐步提高DDP浓度，每次提高约50%，直至细胞可在含有1 mg/L DDP的培养液中稳定生长，将此耐药细胞株命名为H446/DDP。

1.2.3细胞活力检测与药物联合效用评价 将H446细胞和H446/DDP细胞以每孔5 000个接种于96孔板，常规培养24 h，分别加入不同剂量PLM和DDP，同时设空白组和对照组，每组设5个复孔，孵育24 h；每孔加入10 μl CCK-8溶液，孵育1 h，用酶标仪于450 nm波长处检测各孔吸光度A值；计算细胞活力(cell viability)，细胞活力=(加药组A值-调零组A值)/(对照组A值-调零组A值)×100%；使用SPSS16.0软件计算药物的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)，并计算出耐药倍数与逆转倍数，耐药倍数=耐药细胞IC50/敏感细胞IC50，逆转倍数=耐药细胞IC50/PLM作用下IC50；使用CompuSyn软件计算出在不同抑制效应(fraction affected,Fa)下的药物联合指数(combination index,CI)，并绘制出Fa-CI曲线。

1.2.4细胞凋亡检测 取对数生长期H446/DDP细胞，将其分为对照组、DDP组、PLM组和DDP+PLM组，其中DDP和PLM的终浓度分别为6 mg/L和2 mg/L；药物处理24 h后，收集各组细胞，PBS洗涤2次，用结合缓冲液重悬细胞，调整细胞密度至5×105个/ml，取200 μl细胞悬液，加入5 μl AnnexinV-FITC和10 μl碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色液，轻轻混匀，4℃避光孵育15 min，送流式细胞仪分析检测。

1.2.5细胞周期检测 细胞分组同1.2.4段，收集各组细胞，PBS洗涤2次，加入1 ml 冰预冷的75%乙醇，-20℃固定2 h，PBS洗涤2次，加入PI染色液，室温避光孵育15 min，使用流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.6Western印迹法检测蛋白水平 用不同剂量 PLM(0、2、4 mg/L)处理H446/DDP细胞24 h后，收集各组细胞，加入RIPA裂解液，冰上孵育15 min，4℃下12 000 g离心30 min后取上清，用紫外分光光度法检测样品蛋白浓度，取25 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳并转印到PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭1 h，TBST洗膜2次，加入一抗(1∶1 000稀释)，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入二抗(1∶2 000 稀释)室温下孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL进行曝光反应，显影，拍照，使用ImageJ 1.45s软件分析目标蛋白的相对灰度值。

2 结果

2.1耐药前后相关蛋白表达水平的变化 如图1所示，与亲代H446细胞相比，耐药株H446/DDP细胞中P-gp、MRP1、GSTP1和Survivin蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05)。这提示H446细胞顺铂耐药性的产生可能与P-gp、MRP1、GSTP1和Survivin蛋白的高表达有关。

2.2PLM与DDP对细胞活力的影响 如图2所示，与对照组相比，经不同剂量PLM和DDP处理24 h 后， H446和H446/DDP细胞活力均显著下降(P<0.05)，且随药物剂量的增加呈下降趋势；DDP对H446和H446/DDP细胞的IC50分别为1.21 mg/L和13.76 mg/L，PLM对H446/DDP细胞的IC50为6.29 mg/L；当PLM与DDP按1∶3浓度比联用时，IC50为7.28 mg/L(其中DDP的浓度为5.46 mg/L)；H446/DDP细胞的耐药倍数为11.37， PLM对H446/DDP细胞的逆转倍数为2.52。这表明PLM可增强DDP对H446/DDP细胞的抑制作用。

图1 H446和H446/DDP细胞中P-gp、MRP1、GSTP1和Survivin蛋白的表达Fig.1 Protein levels of P-gp,MRP1,GSTP1 and Survivin in H446 and H446/DDP cellsNote:A.Western blot analysis;B.Statistical analysis;*.P<0.05 versus H446 group.

图2 PLM与DDP对H446和H446/DDP细胞活力的影响Fig.2 Effect of PLM and DDP on cell viability in H446 and H446/DDP cellsNote:A.H446 cells;B.H446/DDP cells.*.P<0.05 versus control group;#.P<0.05 versus the same concentration DDP group.

2.3PLM与DDP联合效应分析 Chou-Talalay中效分析法结果显示，在不同抑制效应Fa值下，联合指数CI值均小于1，这说明PLM与DDP联用可产生协同效应，见图3。

2.4PLM与DDP对细胞凋亡的影响 如图4所示，与对照组相比，PLM组、DDP组和DDP+PLM组细胞凋亡率均显著升高(P<0.05)；同时，DDP+PLM组细胞凋亡率显著高于DDP组(P<0.05)。这表明PLM可协同增强DDP诱导的H446/DDP细胞凋亡。

图3 抑制效应-联合指数曲线Fig.3 Graph of fraction affected(Fa)and combination index(CI)

图4 PLM和DDP对H446/DDP细胞凋亡的影响Fig.4 Effect of PLM and DDP on apoptosis of H446/DDP cellsNote:A.Apoptosis detection;B.Statistical analysis.*.P<0.05 versus control group;#.P<0.05 versus DDP group.

图5 PLM和DDP对H446/DDP细胞周期的影响Fig.5 Effect of PLM and DDP on cell cycle of H446/DDP cellsNote:A.Cell cycle detection;B.Statistica analys.*.P<0.05 versus control group;#.P<0.05 versus DDP group.

图6 PLM对H446/DDP细胞耐药相关蛋白表达的影响Fig.6 Effect of PLM on expression levels of resistance-related proteins in H446/DDP cellsNote:A.Western blot analysis;B.Statistica analysis.*.P<0.05 versus control group;#.P<0.05 versus 2 mg/L group.

2.5PLM与DDP对细胞周期的影响 如图5所示，与对照组相比，PLM组、DDP组和DDP+PLM组细胞G0/G1期细胞比例显著降低(P<0.05)，S期细胞比例显著升高(P<0.05)；与DDP组相比，DDP+PLM组G0/G1期细胞比例明显降低(P<0.05)，S期细胞比例显著升高(P<0.05)。这表明DDP和PLM可诱导H446/DDP细胞发生S期阻滞，且二者联用效应更强。

2.6PLM对相关蛋白表达水平的影响 如图6所示，与对照组相比，经2 mg/L或4 mg/L PLM处理24 h后， H446/DDP细胞中P-gp、MRP1、GSTP1、Survivin、Cyclin A和CDK2蛋白表达水平均显著下降(P<0.05)，且随PLM剂量的增加呈下降趋势。

3 讨论

化疗是治疗中晚期恶性肿瘤患者的重要手段之一，然而耐药性的产生严重制约了化疗的效果，甚至导致化疗失败。肺癌化疗耐药性的形成是一个多因素参与的复杂过程，涉及细胞内化疗药物的代谢与积累，以及抗凋亡能力等方面。下调P-gp和MRP1蛋白表达可抑制肺癌细胞对DDP的外排作用，从而逆转肺癌细胞对DDP的耐药性[9,10]。而上调GSTP1和Survivin蛋白表达可减弱DDP对肺癌细胞的杀伤作用[11,12]。本研究结果显示，耐药株H446/DDP细胞对DDP的耐药倍数为11.37，其P-gp、MRP1、GSTP1和Survivin蛋白表达水平也均显著高于亲代H446细胞。这表明上述蛋白可能在H446细胞获得DDP耐药性的过程中发挥着重要作用。

PLM是一种提取自胡椒科植物荜茇的生物碱类化合物，具有抗血小板凝集、抗阿尔兹海默病、抗血小板聚集、抗炎、抗抑郁和镇痛等药理学作用[13-16]。近年来PLM的抗肿瘤作用逐渐成为研究的热点。PLM可通过引发氧化应激诱导黑色素瘤细胞凋亡[3]，也可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制结肠癌细胞增殖[4]，还可通过下调P-gp、MRP1和ABCG2蛋白表达逆转人视网膜母细胞瘤耐药株HXO-RB44/VCR和SO-Rb50/CBP细胞耐药性[8]。本研究结果表明，PLM可协同增强DDP对H446/DDP细胞的杀伤作用，逆转倍数为2.52。

肿瘤细胞可通过ATP 结合盒(ATP-binding cassette,ABC)转运蛋白将化疗药物外排至细胞外，使肿瘤细胞内化疗药物含量降低，最终导致多药耐药性。P-gp和MDR1为ABC转运蛋白家族的重要成员。Fang等[10]研究显示，抑制STAT3活化可下调肺癌耐药株A549/DDP细胞中MDR1和MRP1基因表达，进而逆转其耐药性。吴秋歌等[17]研究证实，抑制P-gp表达可提高H446细胞对DDP的敏感性。Zhao等[18]研究显示，SCLC耐药株H69/DDP细胞中MDR1蛋白表达显著升高。本研究结果表明，PLM可剂量依赖性地下调H446/DDP细胞中P-gp和MRP1的蛋白表达水平，这可能是PLM逆转H446/DDP细胞耐药性的机制之一。

GSTP1可催化谷胱甘肽与DDP的结合反应，使后者无法进入细胞核与靶点DNA结合，从而降低肿瘤细胞对DDP的敏感性[19]。Survivin为目前发现的作用最强的凋亡抑制因子，在肺癌细胞DDP耐药性的形成过程中发挥着重要作用[11]。Wu等[20]研究显示，下调GSTP1蛋白表达可增强H446/DDP对DDP的敏感性。Tang等[11]研究证实，H446/DDP细胞中Survivin蛋白呈高表达，抑制PI3K/Akt1通路可下调Survivin蛋白，继而逆转其DDP耐药性。本研究表明，PLM可剂量依赖性地下调H446/DDP细胞中GSTP1和Survivin的蛋白表达水平。

Song等[3]研究证实，PLM可上调人黑色素瘤A375和A875细胞中p21和p27蛋白表达，导致其发生G2/M期阻滞。Wang等[8]研究显示，PLM可通过下调CDK1蛋白表达阻滞人视网膜母细胞瘤细胞于G0/G1期和G2/M期。而下调Cyclin A和CDK2表达会使肿瘤细胞阻滞于S期，从而引起肿瘤细胞凋亡[21,22]。本研究证实，PLM可剂量依赖性地下调Cyclin A和CDK2蛋白表达，并与DDP协同阻滞H446/DDP细胞于S期。

综上所述，PLM可在体外逆转人小细胞肺癌耐药株H446/DDP细胞耐药性，这可能与其下调P-gp、MRP1、GSTP1、Survivin、Cyclin A和CDK2蛋白表达水平，进而增强DDP诱导的细胞凋亡和S期阻滞有关。