银莲花素A对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠自噬的调控作用及机制研究①

杨 滢 李作孝 (西南医科大学附属医院神经内科,泸州 646000)

多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)是一种典型的自身免疫性神经退行性疾病，其发病特征为外周促炎细胞侵入中枢神经系统并导致多灶性炎性脱髓鞘。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalitis，EAE)是MS的理性动物模型。在自身免疫过程中，细胞自噬与固有免疫及适应性免疫紧密关联，有研究显示细胞自噬直接参与MS或者EAE的进展[1]。银莲花素A(raddeanin A，RA)，又名竹节香附素A，是中药两头尖提取出的三萜皂苷，近来研究证明其具有免疫调节、抗炎、抗肿瘤、诱导肿瘤细胞凋亡和自噬等作用[2]。RA对胃癌SGC-7901细胞的研究中，通过透射电镜观察及自噬相关蛋白表达检测，显示RA可能通过调控p38MAPK/mTOR通路诱导胃癌细胞自噬实现抗肿瘤作用[3]。本研究通过观察RA对EAE小鼠发病情况、自噬标志物LC3蛋白以及p38MAPK、mTOR、p70S6K蛋白表达变化的影响，探讨其对EAE小鼠自噬的调控及其可能机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物及分组 C57BL/6小鼠60只，体重18～22 g，周龄6～8周，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，饲养于西南医科大学动物房。将小鼠随机分为空白对照组、EAE模型组及RA低、中、高剂量组，每组12只。

1.1.2药品及主要试剂 竹节香附素A(中国食品药品检定研究所)，MOG35-55多肽(上海吉尔生化有限公司)，结核分枝杆菌H37Ra(上海瑞楚生物科技有限公司)，百日咳毒素(美国sigma公司)，Luxol Fast Blue染液试剂盒(ASPEN公司)，DAPI染液(武汉阿斯本生物技术有限公司)，兔抗小鼠p-p38抗体、兔抗小鼠多克隆微管相关蛋1轻链3B(LC3B)抗体(CST公司)，兔抗小鼠 p-mTOR、p-p70S6K抗体(abcam公司)，山羊抗兔HRP(ASPEN公司)。

1.2方法

1.2.1EAE模型制备及处理 将MOG35-55溶于PBS(0.01 mmol/L)，浓度为2 mg/ml，TB溶于CFA，浓度为10 mg/ml[4]。将上述两组液体充分混合，通过三通管冰浴快速反复双向推送，直至形成油包水状态，分别对EAE模型组及RA低、中、高剂量组小鼠于两前肢、两后肢与脊柱连线处皮下注射(每只0.2 ml)。免疫当天为第0天,于第0、2天给造模小鼠每只腹腔注射PTX 0.2 ml(0.5 μg)。自免疫日起，RA低剂量、中剂量、高剂量组分别腹腔注射RA 0.05、0.1、0.2 mg/kg，每日注射一次，连续10 d。空白对照组、模型组每日腹腔注射等量生理盐水。各EAE小鼠于发病高峰期处死取材，空白对照组观察4周处死取材。

1.2.2各组小鼠发病情况观察 自免疫日起至第28天，遵循双盲原则，每日同一时间(上午9：00) 由同一人观察各组小鼠的临床症状、神经功能缺损评分，用Weaver 15分法：①尾巴：无症状0分，张力减低或远端瘫痪1分，全瘫2分；②四肢：无症状0分，步态不稳计1分，轻瘫、行走时摇曳2分，全瘫、行走时外翻计3分；③死亡计15 分。尾部和四肢的评分相加得总分。

1.2.3组织病理LFB染色 4%多聚甲醛灌流体内组织固定，分离脊髓组织，4%多聚甲醛充分固定48 h，石蜡包埋，制备厚度6 μm切片，取切片脱蜡、脱水，放入Luxol Fast Blue染液中60℃水浴中24 h，分化、风干、封片。

1.2.4免疫荧光检测LC3蛋白表达 取脊髓组织石蜡切片置于65℃烘箱中烘片2 h，脱蜡水化，抗原修复，自然冷却后PBS洗涤5 min×3次，于3%过氧化氢溶液中室温下避光孵育10 min，5% BSA封闭20 min，每张切片加入约50 μl一抗兔抗LC3(1∶50)，4℃过夜。次日，PBS洗去一抗，每张切片加50 μl～100 μl CY3标记山羊抗兔(1∶50)，37℃孵育50 min，经PBS洗涤每张切片加50～100 μl DAPI染液，室温避光孵育5 min，PBS洗涤5 min×3次，滴加抗荧光淬灭剂，封片，荧光显微镜下观察。

1.2.5Western blot检测LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p-p38MAPK、p-mTOR、p-P70S6K蛋白表达 冰上快速取小鼠脊髓组织，并提取蛋白，BAC法测定蛋白浓度，经过SDS-PAGE电泳、分离、转模封闭，加入一抗LC3(1∶1 000)、p-p38MAPK(1∶1 000)、p-mTOR(1∶1 000)、p-p70S6K(1∶1 000)、GAPDH(1∶10 000)，4℃孵育过夜；次日洗涤后加入二抗HRP-Goat anti Rabbit(1∶10 000)，室温孵育30 min，用TBST 在室温下摇床上洗5 min×3次。洗膜后，进行化学发光反应，显影、定影，AlphaEaseFC软件处理系统分析目标带的光密度值。

2 结果

2.1各组小鼠发病情况 空白对照组小鼠未出现神经系统行为学症状。EAE模型组及RA低、中、高剂量组出现不同程度发病，起初精神萎靡、反应迟钝、摄食减少及体重下降等，逐渐出现尾部张力下降、共济失调、大小便失禁，严重者出现四肢瘫痪。各组小鼠未出现死亡。与EAE模型组对比，RA各剂量组小鼠发病潜伏期延长(P<0.01)，进展期缩短(P<0.05或P<0.01)，发病高峰期神经功能评分下降(P<0.05或P<0.01)，随着RA剂量增加作用明显，且RA各剂量组间两两比较P均<0.05。各组间差别见表1。

2.2各组小鼠脊髓组织LC3分布情况(见图1) 空白对照组小鼠未见明显脱髓鞘，EAE模型组、RA低剂量组、中剂量组、高剂量组小鼠白质可见大小不等的片状髓鞘脱失区域。EAE模型组髓鞘脱失最明显，并存在大量空泡化改变，RA药物干预组脱髓鞘情况较轻，空泡化程度较低，且随着剂量的增加，脱髓鞘的情况逐渐减轻。

GroupsIncubationperiod(d)Progressperiod(d)Neurological deficit scoresin peak onset in miceBlank control group--0EA model group10.17±2.417.67±1.238.17±1.64RA low dose group13.58±2.112)6.25±1.421)6.83±1.701)RA medium dose group15.83±1.852)3)4.58±1.622)3)4.58±1.442)3)RA high dose group17.92±1.172)3)4)3.42±1.172)3)4)2.57±1.072)3)5)

Note:Compared with EAE model group,1)P<0.05,2)P<0.01;compared with RA low dose group,3)P<0.01;compared with RA medium dose group,4)P<0.05,5)P<0.01.

图1 各组小鼠脊髓组织脱髓鞘情况比较(LFB染色×200)

2.3各组小鼠脊髓组织LC3分布情况(见图2) EAE模型组LC3散乱分布无明显点状聚集现象，RA药物干预组小鼠神经元LC3表达增强，可见点状阳性亮点，且随着药物剂量增加，LC3表达增强。

2.3各组小鼠脊髓组织自噬标志物LC3Ⅱ/LC3Ⅰ灰度值比值 空白对照组、EAE模型组、RA低、中、高剂量组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ灰度值比值分别是0.529±0.059、0.245±0.027、0.308±0.046、0.412±0.048、0.467±0.043。与空白对照组比，EAE模型组脊髓组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ灰度值比值下降(P<0.05)。与EAE模型组相比，RA低、中、高、剂量组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ灰度值比值均升高，随着RA剂量增加作用越明显，且RA各剂量组间两两比较P均<0.05。见图3、4。

图2 各组小鼠脊髓组织LC3免疫荧光分布情况(×200)

图3 各组小鼠脊髓组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达(n=6)

图4 各组小鼠脊髓组织LC3、p-P38、p-mTOR、p-p70S6K表达对比(Western blot)

Groupsp-p38MAKPp-mTORp-p70S6KBlank control group 0.026±0.0070.149±0.0290.065±0.018EA model group0.600±0.0141)0.671±0.0451)1.122±0.0871)RA low dose group0.277±0.0281)2)0.566±0.0451)2)0.688±0.0471)2)RA medium dose group0.125±0.0221)2)3)0.377±0.0601)2)3)0.345±0.0451)2)3)RA high dose group0.051±0.0191)2)3)4)0.280±0.0531)2)3)4)0.144±0.0121)2)3)4)

Note:Compared with the blank control group,1)P<0.05;compared with the EAE model group,2)P<0.01;compared with the RA low dose group,3)P<0.01;compared with the RA medium dose group,4)P<0.01.

2.3各组小鼠脊髓组织p-p38MAKP、p-mTOR、p-p70S6K通路蛋白的表达 与空白对照组对比，EAE模型组脊髓组织p-P38MAKP、p-mTOR、p-p70S6K表达升高(P<0.05或P<0.01)与EAE模型组对比，RA低、中、高、剂量组脊髓组织p-P38MAKP、p-mTOR、p-p70S6K表达下降，随着RA剂量增加作用明显，且RA各剂量组间两两比较P均<0.01。见表2。

3 讨论

既往研究表明，自噬作为降解细胞内物质的生物过程，可通过其免疫调节作用参与淋巴细胞的生成与维持、异物的清除、抗原递呈及对炎症反应的调控，与MS的发病机制密切相关[5]。诱导自噬可抑制炎症反应的发生，维持血脑屏障功能完整，减轻脱髓鞘，延缓MS或EAE病情进展。LC3是一种与自噬体形成相关的微管结合蛋白，是自噬的标志性蛋白，主要控制自噬途径的步骤包括自噬膜的生长、自噬货物的识别及自噬体与溶酶体的融合[6]。LC3存在两种形式，细胞内新合成的LC3经过加工，成为胞质可溶形式的LC3Ⅰ，经过泛素样系统的脂化，形成膜结合形式的LC3Ⅱ。LC3Ⅱ定位于前自噬体和自噬体，随着自噬体膜的增多而增多。因此LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，与自噬体的数量呈正相关，为自噬水平的指标[7]。本研究显示与空白对照组对比，EAE模型组脊髓组织LC3散乱分布无明显点状聚集现象，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降，提示EAE在发病高峰期自噬水平降低。

P38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族的重要组成部分，已有4种p38亚型被发现，主要在细胞应激、炎性刺激时可被磷酸化激活，进而引发下游效应分子的激活[8]。既往研究显示应用p38α/β抑制剂可减轻EAE小鼠的症状，延缓病程进展[9]。P38MAPK是细胞信息传递的交汇点或共同通路，在炎性反应、细胞凋亡、自噬、衰老等过程中发挥重要作用[10]。自噬相关信号转导通路主要包括雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，TOR)依赖的通路(PI3K/Akt/mTOR，AMPK/mTOR，MAPK/mTOR通路)，和非TOR依赖的通路。mTOR是自噬诱导的关键调节因子，通过p38MAPK信号转导可活化mTOR，进而抑制自噬[11]。mTOR可通过刺激活化其下游的p70S6K，调控基因的转录和翻译，促进细胞的蛋白质合成、增殖及生长[12]。本实验显示与空白对照组、EAE模型组p38MAPK、mTOR、p70S6K磷酸化比较对照组有所增高。表明EAE小鼠脊髓组织发病高峰存在自噬缺陷，可能与p38MAPK、mTOR、p70S6K通路蛋白磷酸化有关。

三萜皂苷广泛分布于自然界，大多数以游离态或与糖成苷类或成酯存在，含有三萜皂苷类成分的中药主要有人参、柴胡等，在众多的三萜类化合物中有一类化合物具有独特的生物活性，即齐墩果酸型皂苷，有抗肿瘤、降血糖、降血脂等诸多药理活性[13]。RA是两头尖中提取出的齐墩果酸皂苷之一，以齐墩果烷为母核，以葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖为糖连接成苷，具有较高的含量，有着极好的开发应用价值[14]。RA有较强抗肿瘤作用，目前发现RA能抑制肺癌、结肠癌、肝癌等多种肿瘤细胞的增殖、侵袭和诱导肿瘤细胞凋亡和自噬。在对肠癌细胞HCT116的研究中，显示RA干预后电镜下可见自噬小体形成，自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Belin-1、ATG5、ATG12表达上调，且p-mTOR蛋白表达下降[15]。本研究应用银莲花素A干预EAE小鼠，药物干预组发病潜伏期延长，进展期缩短，神经功能评分降低，且呈剂量依赖关系，病理学显示脱髓鞘情况改善，提示RA对EAE小鼠具有神经保护作用。同时，与EAE模型组对比，RA各干预组小鼠发病高峰期脊髓组织LC3表达增强，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值有所提升，而p-p38MAPK、p-mTOR、p-p70S6K表达有所下降，且呈剂量依赖关系，提示RA可上调EAE小鼠发病高峰期脊髓组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值，诱导自噬产生，其作用机制可能是通过抑制p38MAPK/mTOR通路蛋白激酶磷酸化，但本实验未通过上调或下调通路活化，未准确的指出RA调控p38MAPK通路的靶点，为本实验不足之处，该药的特异性也值得进一步研究。

综上所述，银莲花素A能改善EAE小鼠发病情况及脱髓鞘情况，且呈剂量依赖关系。其作用机制可能是RA通过调控p38MAPK蛋白信号转导，对mTOR蛋白、p70S6K蛋白激酶抑制，上调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值，诱导自噬产生，通过清除胞质中受损细胞器及蛋白起到保护细胞作用，抑制炎症反应，减轻脱髓鞘情况，改善EAE小鼠病情进展。