厚果崖豆藤提取物抑制NF-κB p65的活化对三阴性乳腺癌细胞增殖、凋亡和转移的影响①

何 力 兰戴天 高青山 李 娟 邓小林

(四川省医学科学院·四川省人民医院甲状腺乳腺外科,成都 610100)

乳腺癌是全球女性最常见的癌症，发病率和死亡率都很高[1]。三阴性乳腺癌 (triple-negative breast cancer，TNBC) 以雌激素受体 (ER)、黄体酮受体 (PR) 和人表皮生长因子受体 (HER)-2缺乏表达为特征，占所有类型乳腺癌的15%[2]。TNBC具有早期转移和预后不良的趋势，是一项重大的临床挑战[3]。由于TNBC对内分泌治疗或其他现有靶向药物没有反应，药物治疗的选择仅限于传统化疗，而传统化疗往往陷入耐药性问题[4]。因此，有必要寻找对TNBC具有最小毒性且治疗有效的新化合物。一种新型查尔酮化合物(millepachine，MIL)，该化合物首次从厚果崖豆藤中分离得到，具有2,2-二甲基苯并吡喃基序的苯并芘结构，使其具有足够的亲脂性以确保良好的细胞膜渗透性[5]。MIL在体内和体外均表现出对多种人类癌细胞的强大抗肿瘤作用，作为一种新型的抗癌药物候选药物，由于其结构新颖、抗肿瘤活性强，对药物研发具有潜在的重要意义[6]。因此，本研究选择不同剂量的MIL处理MDA-MB-231乳腺癌细胞，探索MIL对MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖、凋亡和转移的影响是否存在NF-κB通路的参与，以及该通路p65蛋白的表达和核转位情况，从而确定新的治疗靶点，以期为MIL应用于三阴性乳腺癌的治疗提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1材料 DMEM/F12 培养液、胎牛血清、胰酶(Gibco 公司，美国)；Cell Counting Kit-8(CCK-8)(同仁化学公司，日本)；ELX808酶标仪(Bio-Tek公司，美国)；二喹啉甲酸 (Bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒 (PIERCE公司，美国)；MatrigelTM底膜基质 (BD公司，美国)；p65,p-p65抗体(NEB公司，美国)；HRP标记的山羊抗小鼠二抗(Santa Cruz公司，美国)；细胞凋亡检测试剂盒 (Annexin PE/7-AAD) (南京凯基生物有限公司,中国) ；空气恒温摇床(上海福玛实验设备有限公司)；高速低温离心机(Beckman公司，美国)；CO2培养箱(Thermo公司，美国)；电泳槽，电转仪(Bio-Rad公司，美国)；FACS Vantage SE 流式细胞仪(BD公司，美国)；凝胶成像系统GDS-800 UVP(UVP公司，美国)；ChemiDoc XRS 凝胶/发光图像分析仪(Bio-Rad公司，美国)。

1.2方法

1.2.1细胞培养 MDA-MB-231乳腺癌细胞株在补充有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中生长。所有细胞均在含有5%CO2的培养箱中37℃培养。细胞汇合率达到85%以上时用0.25%胰酶进行消化传代。

1.2.2给药剂量与分组 MIL具有2,2-二甲基苯并吡喃基序的苯并芘结构，使其拥有足够的亲脂性从而具有良好的细胞膜渗透性。将MDA-MB-231细胞随机分为4组，分别在4组细胞的血清DMEM培养基中加入0、2、4、8 μmol/L的MIL继续培养48 h。将用不同浓度MIL处理的MDA-MB-231细胞分为：对照组(0 μmol/L MIL)；2 μmol/L MIL处理组；4 μmol/L MIL处理组；8 μmol/L MIL处理组。

1.2.3CCK8检测细胞存活率 将MDA-MB-231细胞传代培养于96孔板中，培养24 h后对细胞进行相应转染后，经不同浓度的MIL处理48 h后，根据试剂盒说明书每孔加入10 μl CCK8试剂并于培养箱中继续孵育2 h，用酶标仪检测各组吸光度，绘制折线图并计算细胞生长速度 (增殖倍数=细胞吸光度/0 h 细胞吸光度)。

1.2.4EDU染色 经不同浓度的MIL处理过的各组细胞，用50 μmol/L的 EDU(EDU labeling/detection kit,Ribobio,Guangzhou,China)培养12 h，用4%的多聚甲醛固定细胞30 min和5%的甘氨酸培养5 min,PBS 洗涤和0.5% Triton X-100破膜后，用抗EDU抗体孵育30 min,再用 5 μg/ml Hoechst 33342 染色30 min,荧光显微镜观察并照相。

1.2.5流式细胞术检测细胞凋亡 将处理过的MDA-MB-231细胞，以1×106个/孔的细胞量接种至6孔板中，置37℃、5%CO2孵箱中孵育72 h。之后分别收集每个孔内的细胞，按凋亡检测试剂盒说明书操作，用Annexin V-FITC和pro-pidium iodide (PI) (凯基生物公司，中国) 双染法在FACS AriaⅡ流式细胞仪 (BD Biosciences,San Diego,CA) 上进行细胞凋亡检测，数据分析使用FlowJo软件 (TreeStar,Ashland,OR,USA)。

1.2.6Transwell 将MIL处理过的细胞消化离心，无血清培养基重悬细胞，以1×104个/孔的细胞数量种入上室，下室加入有血清的培养基。48 h后用无菌棉签擦去小室上层细胞，将Transwell 小室，倒置风干，并放入含有500 μl染色液(0.1%结晶紫)的12孔板中，染色 20 min，取出后在 PBS 中清洗3次，并风干。在Transwell小室直径上，取5个视野，在显微镜下拍照计数。拍照后，在 24孔板中加入500 μl的33%醋酸，将Transwell小室置于其中，浸膜，振荡10 min，充分溶解膜上染色物质。将溶解液转移到96孔板中，于酶标仪上560 nm 测吸光度OD值，以此间接反应侵袭细胞数目。

1.2.7免疫印迹法 使用裂解缓冲液(Beyotime，Shanghai，China)裂解细胞样品。然后，使用BCA蛋白质测定试剂盒(Beyotime)定量蛋白质浓度。含有20 mg蛋白质的样品在10%SDS-PAGE中分离，然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脱脂牛奶室温封闭蛋白2 h，随后加入一抗 (p65,1∶1 000;p-p65,1∶1 000)于4℃封闭过夜，第二天加入对应二抗室温封闭1 h，最后滴加ECL,设置曝光参数，检测目的条带对应化学发光强弱。

1.2.8RT-PCR 使用TRIzol试剂提取总RNA，并通过超微紫外光分光光度计在260和280 nm处测定吸光度。 按照试剂盒说明书，使用Super RT cDNA试剂盒合成cDNA。 此外，使用Quantifast®SYBR®GreenPCR Kit进行PCR，分别在95℃ 15 s 和60℃ 60 s条件下使用ABI 7500将反应激活。 用于该反应的E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和β-actin的引物信息如下：E-cadherin：5′-TGGGTTATTCCTCC-CATCAG-3′,5′-TTTGTCAGGGAGCTCAGGAT-3′； N-cadherin：5′-CACCCAACATGTTTACAATCAACAA-TTGAGAC-3′,5′-CTGCAGCAACAGTAAGGACAAACATCCTATT-3′； Vimentin：5′-GAAGAGAACTTTGCCGTTGAAG-3′，5′-ACGAAGGTGACGAGCCATT-3′； β-actin：5′-CAAAGACCTGTACGCCAACAC-3′。

1.2.9免疫荧光检测p65的细胞核转位 将MDA-MB-231细胞接种到涂有纤连蛋白的玻璃盖玻片上。培养24 h后，PBS冲洗细胞，固定于预冷甲醇中，0.2% Triton X-100渗透。固定细胞在1.5%的正常山羊血清中预孵育，4℃下用一抗p65 (1∶100稀释)孵育过夜。荧光素标记山羊抗兔IgG抗体37℃孵育后，将盖玻片用PermaFluor Aqueous固定在载玻片上。使用Zeiss Axioplan Universal显微镜观察荧光。

2 结果

2.1不同浓度的MIL对MDA-MB-231细胞活力的影响 如图1所示，MDA-MB-231细胞的存活率都以MIL浓度依赖的方式降低，当MIL浓度超过16 μmol/L时，MDA-MB-231细胞的存活率显著降低(P<0.05)。

2.2不同浓度的MIL对MDA-MB-231细胞增殖的影响 如图2A所示，对照组可见大量EDU深色标记的细胞。2、 4、8 μmol/L MIL三个处理组EDU深色标记的细胞较对照组明显减少。如图2B所示，与对照组比较，2、4、8 μmol/L MIL三个处理组EDU阳性细胞数显著减少(P<0.05)。

图1 CCK8检测细胞的存活率

图2 不同浓度MIL处理后MDA-MB-231细胞的增殖变化(EDU，×400)

图3 不同浓度MIL处理后MDA-MB-231细胞凋亡率变化

图4 不同浓度的MIL处理后MDA-MB-231细胞侵袭能力的变化

2.3不同浓度的MIL对MDA-MB-231细胞凋亡的影响 如图3所示，对照组MDA-MB-231细胞凋亡率为(4.6%±0.5%)； 2、4、8 μmol/L MIL三个处理组细胞凋亡率分别为 (4.8%±0.8%)、(20%±2.3%)、(28.5%±2.9%)，较对照组明显升高，但差异无统计学意义。

2.4不同浓度的MIL对 MDA-MB-231细胞侵袭力的抑制作用 如图4A所示，与对照组比较，可观察到4 μmol/L和8 μmol/L MIL两个处理组侵入到小室膜底侧的MDA-MB-231细胞数量明显减少；如图4B所示，与对照组比较，4 μmol/L和8 μmol/L MIL两个处理组的侵袭细胞数显著降低(P<0.05)。

图5 不同浓度MIL处理后E-cadherin,N-cadherin,Vimentin mRNA的表达

图6 不同浓度的MIL处理后p65磷酸化和p65核转位的变化

2.5不同浓度的MIL对E-cadherin,N-cadherin,Vimentin表达的影响 如图5所示，与对照组比较，2 μmol/L、4 μmol/L和8 μmol/L MIL处理组Vimentin mRNA的表达均显著降低(P<0.05)；4 μmol/L 和8 μmol/L MIL两个处理组E-cadherin mRNA的表达均显著升高(P<0.05)；4 μmol/L和8 μmol/L MIL两个处理组N-cadherin mRNA的表达均显著降低(P<0.05)。

2.6不同浓度的MIL对p65磷酸化和p65核转位的影响 如图6A所示，从Western blot条带中可以看出，4 μmol/L和8 μmol/L MIL两个处理组p-p65蛋白表达量对照组降低。Western blot灰度分析结果：与对照组比较，4 μmol/L和8 μmol/L MIL两个处理组p65磷酸化水平显著降低(P<0.05)。如6B所示，免疫荧光染色法实验发现对照组核转位细胞的NF-κB p65荧光标记主要浓集于核区，胞质区减少，4 μmol/L和8 μmol/L MIL两个处理组核转位细胞的NF-κB p65荧光标记主要浓集于胞质区，核区减少，没有明显显现。如图6C所示,与对照组比较，4 μmol/L和8 μmol/L MIL两个处理组核转位细胞的NF-κB p65荧光标记在核区显著减少(P<0.05)。

3 讨论

乳腺癌是世界上最常见的癌症，也是女性癌症死亡的主要原因[7]。尽管过去二十年来诊断和治疗方式的进步提高了乳腺癌患者的生存率，但由于TNBC具有侵袭性和转移性，且缺乏有效的治疗方法，因此与其他亚型乳腺癌相比，TNBC复发和死亡的风险仍然较高[8]。系统性常规化疗是TNBC患者唯一的治疗选择，因为缺乏已建立的靶点，如雌激素受体和HER2[9]。因此，迫切需要开发新的有效、安全的TNBC治疗药物。

MIL对人体癌细胞具有很强的抗肿瘤活性，能够抑制癌细胞的增殖。MIL对多种类型的肿瘤具有增殖抑制作用，据报道MIL在卵巢癌细胞中具有抗肿瘤活性，呈剂量依赖性地抑制卵巢癌细胞SK-OV-3和A2780S的增殖[10]。在随后的研究中也发现MIL显著抑制对顺铂耐药的卵巢癌细胞A2780CP的增殖[11]。与前人研究结果类似，本研究发现MDA-MB-231细胞经不同浓度MIL处理后，细胞增殖明显降低，且MIL对MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖关系。本研究发现，MIL 对MDA-MB-231细胞增殖具有明显的抑制作用，表明MIL能抑制MDA-MB-231细胞的生长。

MIL在体内和体外可以诱导癌细胞凋亡。已有研究发现MIL通过ROS介导的线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡，线粒体膜电位呈剂量依赖性降低[6]。Wu等[10]研究发现MIL以浓度依赖性方式诱导SK-OV-3和A2780S细胞凋亡。同样地，MIL可诱导顺铂敏感的A2780S和耐顺铂的A2780CP细胞显著凋亡[11]。与前人的研究结果类似，本研究发现MIL能够明显提高MDA-MB-231细胞凋亡率，但差异无统计学意义。这可能与MIL在不同的癌症中诱导细胞凋亡所起作用的差异有关，其有待以后进一步的研究。Wu等[6]采用流式细胞术检测凋亡细胞的数量，发现经过MIL处理后凋亡的HepG2细胞百分比从40.0%上升到77.1%，SK-HEP-1细胞也呈现出明显的剂量依赖性凋亡。 用AO/EB染色观察凋亡细胞的形态学特征，观察到明显的细胞凋亡形态学改变，包括膜起泡和颗粒性凋亡小体；流式细胞术检测发现雷公藤红素可诱导MDA-MB-231和BT-549细胞凋亡本研究发现MIL能够明显提高MDA-MB-231细胞凋亡率，但差异无统计学意义。这可能与MIL在不同的癌症中诱导细胞凋亡所起作用存在差异有关，其有待以后进一步研究。

恶性肿瘤细胞具有向周围正常组织浸润和侵袭的能力[12]。在有关MDA-MB-231细胞侵袭能力的研究中，Jeon等[13]研究发现IL-1 b增强TNBC细胞的侵袭能力，花姜酮处理后降低了MDA-MB231细胞和Hs578T细胞的侵袭率，即 TNBC细胞的侵袭能力下降。Hseu等[14]测量MDA-MB-231细胞侵袭数发现据报道，通过香杉芝治疗后可显著降低MDA-MB-231细胞侵袭能力；在怡莱霉素C治疗条件下，MDA-MB-231和BT-549细胞数量明显减少，侵袭率降低，引起两种TNBC细胞侵袭能力降低[15]。相似的，本研究发现MIL能够明显降低MDA-MB-231细胞的侵袭数，表明MIL具有抑制TNBC细胞侵袭能力的作用。

上皮-间充质转化(epithelial-mensenchymal transition，EMT)是一种与迁移和侵袭相关的重要机制，而 EMT 的发生通常伴随着标志物的变化，主要包括E-cadherin、N-cadherin和Vimentin。E-cadherin的转录和蛋白水平的恢复与乳腺癌细胞的细胞增殖和转移抑制有关。Hseu等[14]研究发现使用香杉芝治疗后，剂量依赖性地提高了E-cadherin的mRNA表达，降低了N-cadherin的mRNA表达，用香杉芝处理MDA-MB-231细胞时，下调vimentin的表达，延缓了乳腺癌细胞的转移[14]。MIL具有一定的抗肿瘤作用，其可通过降低Eg5蛋白的水平从而在抗肿瘤上起着一定作用[16]。在顺铂耐药的人卵巢癌中，MIL的抗肿瘤作用与其ATP结合转运蛋白的表达受到抑制有关[11]。类似的，本研究发现MIL能明显降低N-cadherin和vimentin的mRNA表达，以及明显提高E-cadherin mRNA的表达，表明MIL能够抑制TNBC的上皮-间充质转化过程。

NF-κB与肿瘤的发生、转移及对肿瘤的耐药性有关，NF-κB活化在乳腺癌的发生发展中起着至关重要的作用[17]。活化的NF-κB会增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，并抑制促凋亡蛋白Bax，这与化疗诱导的细胞凋亡有关[18]。研究发现香杉芝处理的细胞中呈剂量依赖性抑制NF-κB活化，降低 NF-κB p65蛋白水平[14]。同样，人参皂苷Rg3联合紫杉醇可抑制NF-κB的活化并调节Bax/Bcl-2的表达，从而促进MDA-MB-231细胞凋亡[19]。目前尚未有MIL对NF-κB活化的相关研究，本研究发现MIL明显抑制p65磷酸化水平，减少核区核转位细胞的NF-κB p65荧光标记量，表明MIL能够有效地抑制NF-κB p65的活化。

综上所述，本研究选择不同剂量的MIL处理MDA-MB-231乳腺癌细胞，发现MIL通过抑制NF-κB p65的活化有效抑制MDA-MB-231细胞增殖、侵袭能力并促进其发生凋亡，表明MIL对三阴性乳腺癌有缓解作用，为MIL应用于三阴性乳腺癌的治疗提供理论和实验依据。