基于matK序列将中药石斛鉴定到属

黄周英 桑庆亮 陈怀宇

摘 要：以兰科的石斛属、石仙桃属、石豆兰属等14属matK全长CDS为研究对象，通过比较属内、属间序列两两p-距离，得到属内p-距离上限和属间p-距离下限，并以石斛属、石豆兰属和石仙桃属3个近缘属的matK部分CDS为待检序列进行实地鉴定.结果表明，基于matK可清楚地将石斛属、石仙桃属、石豆兰属序列鉴定到其对映的属，表明基于matK序列可将中药石斛鉴定到属.

关键词：中药石斛;matK;鉴定

中图分类号：S567.239  文献标识码：A  文章编号：1673-260X（2020）01-0052-04

石斛属在分类学上属于兰科树兰族石斛亚族，我国共有74种2变种[1].我国石斛属植物主要分布在秦岭——淮河以南各省区，其中以云南省石斛种类为最多[2].2015年版《中华人民共和国药典》[3]收载的中药石斛为金钗石斛、鼓槌石斛和流苏石斛的栽培品及其同属植物近似种新鲜或干燥茎，其干燥品具益胃生津，滋阴清热的功效，同时提及“及其同属植物近似种”，即表示原植物仍未明确之意.

实际上，各地栽培和开发的中药石斛多达近40种[4，5]，但究竟哪种石斛属物种为中药石斛的正源尚无定论[6，7];中药石斛中常混有金石斛属、石仙桃属、石豆兰属某些物种[4]，这给中药石斛在医学上的应用带来了很大的问题，因此，建立一套行之有效的鉴定方法是解决这些问题的重要一环.

matK基因是位于叶绿体trnK基因第1号内含子中的成熟酶基因，参与II类内含子的剪接，是已知进化速度最快的叶绿体编码基因，一般认为matK可以作为单独使用的植物条形码[8，9]，且因此得到CBOL的Plant Working Group推荐作为植物的条形码[10].事实上，单独使用matK仍无法完全解决问题，尤其是对于复杂的类群需有针对性地将matK与rbcL组合才可达到目的[10]，也就是说，仍没有一种可以通用的植物条形码序列.

研究表明，matK能识别90%的兰科植物[11]，在将matK应用于石斛属鉴定的实践中，刘静等[12]、腾艳芬等[13]、Srikulnath等[14]、钟志敏[15]的研究均认为matK至少在不同程度上可以用于石斛属物种的分子鉴定，而黄海等[16]、Xu等[17]认为matK序列并不适于作为石斛属DNA条形码鉴定.为此，十分有必要对matK在石斛属，乃至兰科植物鉴定中的作用进行全面的评估，为建立完整的石斛属植物鉴定方法提供依据.

本文以叶绿体基因matK全长CDS为依据，比较分析了石斛属、石仙桃属、石豆兰属等14个属的属内、属间p-距离差异，并选取石斛属、石仙桃属、石豆兰属matK部分CDS进行鉴定，以依据matK序列将物种鉴定到属.

1 材料与方法

1.1 材料

从GenBank数据库提取石斛属、石豆兰属、石仙桃属、贝母兰属、虾脊兰属、斑叶兰属、兰属、开唇兰属共8个兰科属，与水稻属、玉蜀黍属、小麦属、甘蔗属共个禾本科属以及芸苔属、鼠耳芥属共2个十字花科属的matK全长CDS及石仙桃属、开唇兰属、石豆兰属长度大于1100bp的matK序列（表1）.

1.2 方法

1.2.1 序列获取

使用Biopython[18]的Entrez模块调用NCBI的Entrez检索系统检索并获取所需matK序列，对数据文件解析后提取其序列及相关信息.

1.2.2 序列比对、p-距离计算及绘图

采用muscle[19]进行多序列比对，采用megacc[20]计算p-距离（p-distance）[21]，提取p-距离数据后使用python环境下的matplotlib模块和seaborn模块绘图.

1.2.3 统计检验

数据组间的差异采用Wilcoxon检验[22]，在Python环境下使用scipy.stats模块实现.

2 结果与分析

2.1 属内、属间p-距离比较

2.1.1 各属属内p-距离比较

将供试14个属matK序列属内p-距离绘成箱形图（图1），结果表明，不同属matK序列属内p-距离变化范围差异较大，大部分小于0.04，个别属内差异较大，如开唇兰属（属内p-距离可达0.08）.因此，属内p-距离上限需根据各属的具体情况而定，对于石斛属来说，该值可定为0.02，而对于开唇兰属来说，则可定为0.04，即当某未知序列与石斛属matK序列的p-距离小于0.02，即可认为该序列来自石斛属物种.

2.1.2 石斛属与各属间两两p-距离比较

将石斛属matK序列分别与供试14个属的matK序列进行属间两两序列p-距离计算，结果绘成箱形图（图2），可以看出，按照与石斛属间p-距离由小到大排列为石斛属（属内）、虾脊兰属、贝母兰属、石仙桃属、石豆兰属、兰属、斑叶兰属、开唇兰属、小麦属、水稻属、玉蜀黍属、甘蔗属、芸苔属和鼠耳芥属.石斛属与同科其他属间p-距离数值均小于0.1，而与禾本科4个属之间的属间p-距离为0.2～0.25之间，表明亲缘关系越远，matK序列差异越大.

但石斛属matK序列与同科的虾脊兰属、贝母兰属、石仙桃属和石豆兰属差异较小，p-距离数值小于0.05且与石斛属内p-距离相比差异不显著（P>0.05），因此难以准确鉴别;开唇兰属、斑叶兰属及兰属与石斛属间的p-距离则与石斛属内p-距离相比有显著差异（P<0）.兰科与禾本科之间0.1-0.2之间为科之间的gap区，说明matK序列可用于区分不同科.

2.1.3 近缘属两两之间p-距离的比较

为进一步弄清这些近缘属间是否可基于matK这一单一序列可区分，将石斛属与其他各属进行两两作图（图3），可以明显看出，石斛属与贝母兰属、石仙桃属、石豆兰属、虾脊兰属、开唇兰属、斑叶兰属、兰属及不同科的鼠耳芥屬均可以借助matK序列明确可分（P<0.01），属内与属间p-距离的交叠区很小.因此，可基于matK序列鉴定到属.

其中，A-H分别为石斛属与虾脊兰、贝母兰属、兰属、石仙桃属、石豆兰属、斑叶兰属、开唇兰属及鼠耳芥属两两之间属内、属间的p-距离比较;Wilcoxon检验结果标记在两属箱图上方，“*”代表显著差异（p<0.05），“**”代表极显著差异（p<0.01）.

2.2 matK序列归属鉴定

以石斛属、石仙桃属、石豆兰属的matK序列序列作为待检序列，分别与上述14个属两两组合，比对并计算两两属间p-距离，依据以下标准判断等检序列的归属：

（1）在所分析属中值最小;（2）低于该属内上限.

2.2.1 石斛属matK部分CDS的鉴定结果

将获取的石斛属matK序列作为待检序列分别与各属matK全长CDS组合后比对并计算p-距离，石斛属待检序列与其余各属间的p-距离分布情况见图4，很明显兰科以外的属与待检序列的p-距离为0.2～0.3，远高于属内p-距离上限，同为兰科的属中，兰属、虾脊兰属、开唇兰属和斑叶兰属与待检序列的p-距离为0.1上下，与石斛属之间比较有显著差异（P<0.01）.因此，待检序列不能鉴定为来自这10个属的物种.

余下的4个属均为兰科石斛属的近缘属，即石斛属、石仙桃属、石豆兰属、贝母兰属，与待检序列间p-距离无显著差异（P值均大于0.05），因此，通过Wilcoxon检验不能找出唯一的结果.但是，比较后发现，待检序列与石斛属间的p-距离最小，石仙桃属次之，然后是贝母兰属和石豆兰属，可据此将待检序列定为石斛属.

A-H分别为石斛属matK待检序列与石仙桃属、石斛属、石豆兰属、开唇兰属、兰属、贝母兰属、斑叶兰属及虾脊兰属两两属间p-距离比较结果.

2.2.2 石仙桃属鉴定结果

以石仙桃属matK部分CDS作为待检序列，分别与各属matK全长CDS两两组合，比对并计算p-距离并绘制箱形图，由图6可见，非兰科的属可很容易地排除在外，同属兰科的斑叶兰属和开唇兰属也有明显gap，石斛属、石豆兰属、兰属和虾脊兰属应也有显著差异（P<0.01），石仙桃属和贝母兰属则明显差异较小，且有明显交叠区（图7F），难以区分（P>0.05）.

A-H分别为石仙桃属matK待检序列与石仙桃属、石斛属、石豆兰属、开唇兰属、兰属、贝母兰属、斑叶兰属及虾脊兰属两两属间p-距离比较结果.

2.2.3 石豆兰属鉴定结果

以石豆兰属matK部分CDS作为待检序列，分别与各属matK全长CDS两两组合，比对并计算p-距离并绘制箱形图，由图8可知，禾本科和十字花科的属与兰科各属间具很大的gap，同属兰科的斑叶兰属、虾脊兰属和开唇兰属与待检序列间的p-距离显著高于石豆兰属（P<0.05），石斛属、石豆兰属、石仙桃属及贝母兰属互有叠区（图9A、B、C），难以区分（P值均大于0.05）.

A-H分别为石豆兰属matK待检序列与石仙桃属、石斛属、石豆兰属、开唇兰属、兰属、贝母兰属、斑叶兰属及虾脊兰属两两属间p-距离比较结果.

3 讨论

3.1 matK序列可将植物鉴定至属

本研究通过对来自兰科、禾本科、十字花科的14个属的比较分析，明确了属内p-距离上限为0.1，属间p-距离下限为0.3.以此gap为基础，建立将matK序列鉴定到属的方法，即将待检序列与目标属的所有matK全长CDS进行两两p-距离计算，从中选择p-距离小于0.1且排在各属最末尾（中位数最小）的属定为该matK序列的物种来源.

然后，以鉴定的属分别对其余各属进行组间Wilcoxon检验，以确定鉴定结果在95%或99%的置信区间内可信，若P>0.05，则可能有多种可能，即结果不唯一.

采用该方法，将石斛属、石仙桃属、石豆兰属物种的待检序列（石仙桃属、石豆兰属与之前建立方法所有序列有部分重叠，其余均不同，且待检对象均为matK序列序列）.待检序列均可成功鉴定至所在属.

3.2 中药石斛鉴定到属的意义

据考证[6，23-25]，中药石斛中常混有来处近缘属，如石豆兰属、石仙桃属、金石斛属等的物种，而且即使来自石斛属的植物，也有多达40种左右被认作中药石斛的原植物[4]，且栽培中经常是多种混种混收[15]，因此混用石斛属植物作为中药石斛成为目前的常态.相比于同属的近缘种，确定待检样品是否属于石斛属对中药石斛道地性的鉴别的第一步，因此，我们认为应首先将中药石斛鉴定到属.

为此，采用matK通过计算比较p-距离的方式，更为精细的鉴别，如种及种以下分类阶的鉴别，有赖于对中药石斛原植物的明确的结论，以及较为细致的序列分析和更为有效的分子序列片段的发掘.

3.3 影响分子鉴定的因素

首先，传统分类中仍然存在很多问题，对很多物种的归属仍存在争议，且中药石斛原植物不明确，这使得分子鉴定缺乏可靠的参照;其次，中药石斛干品难以获取理想的DNA模板，造成序列扩增困难;第三，序列数据库中的序列数量多少不一、质量参差不齐，造成分子鉴定难以获得理想的结果;最后，问题序列的存在有可能造成错误的结论.

参考文献：

〔1〕中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1999.

〔2〕白音.药用三角鉴定方法的系统研究[D].北京：北京中医药大学，2007.

〔3〕国家药典委员会.中华人民共和国药典：2015年版[M].北京：中国医药科技出版社，2015.

〔4〕李满飞，徐国钧，徐珞珊，等.商品石斛的调查与鉴定（ii）[J].中草药，1991，22（4）：173-178.

〔5〕馬国祥，徐国钧，徐珞珊，等.商品三角的调查与鉴定（iii）[J].中草药，1995，26（7）：370-373.

〔6〕金效华，黄璐琦.40[J].中国中药杂志，2015，40（13）：247-251.

〔7〕顺庆生，徐一帆，魏刚，等.中药三斛正本清源之霍山石斛[J].广东药科大学学报，2019（1）：1-4.

〔8〕HILU K. The matk gene： Sequence variation and application in plant systematics [J]. American Journal of Botany， 1997， 84 （6）： 830-839.

〔9〕LAHAYE R， BANK M V D， BOGARIN D， et al. DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots[J]. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2008， 105 （8）： 2923-2928.

〔10〕CBOL-PLANT-WORKING-GROUP. A DNA barcode for land plants[J]. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2009， 106 （31）： 12794-12797.

〔11〕KRESS W J， ERICKSON D L. A two-locus global DNA barcode for land plants： The coding rbcl gene complements the non-coding trnh-psba spacer region[J]. PLoS One， 2007， 2 （6）： e508.

〔12〕刘静，何涛，淳泽.药用石斛的叶绿体matk基因序列分析及鉴别[J].药学学报，2009，44（9）：1051-1055.

〔13〕腾艳芬，吴晓俊，徐红，等.石斛及其常见混淆品的matk基因序列比较[J].中国药科大学学报，2010，33（4）：280-283.

〔14〕SRIKULNATH K， SAWASDICHAI S. Phylogenetic relationship of dendrobium species in thailand inferred from chloroplast matk gene and nuclear rdna its region[J]. The Horticulture Journal， 2015， 84 （3）： 243-252.

〔15〕钟志敏.石斛dna条形码鉴定及系统分类研究[D].广州：广州中医药大学，2018.

〔16〕黄海，李劲松，符岸军，等.石斛属植物dna条形码序列的筛选[J].热带作物学报，2011，31（10）：1769-1777.

〔17〕XU S， LI D， XIANG X， et al. Evaluation of DNA barcodes in dendrobium （orchidaceae） from mainland asia[J]. PLoS One， 2015， 10 （1）： e0115168.

〔18〕COCK P J A， ANTAO T， CHANG J T， et al. Biopython： Freely available python tools for computational molecular biology and bioinformatics[J]. Bioinformatics， 2009， 25 （11）： 1422-1423.

〔19〕EDGAR R C. Muscle： Multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput[J]. Nucleic Acids Research， 2004， 32 （5）： 1792-1797.

〔20〕KUMAR S， STECHER G， PETERSON D， et al. Mega-cc： Computing core of molecular evolutionary genetics analysis program for automated and iterative data analysis[J]. Bioinformatics， 2012， 28 （20）： 2685-2686.

〔21〕NEI M， KUMAR S. Molecular evolution and phylogenetics[M]. New York： Oxford University Press， 2000.

〔22〕吳喜之，赵博娟.非参数统计[M].北京：中国统计出版社，2011.

〔23〕沙文兰，罗金裕.中药石斛鉴定研究——i.石斛原植物和药用调查[J].药学学报，1980，5（6）：351-358，385-386.

〔24〕郑博仁.云南石斛属药材现状及其原植物[J].中国中药杂志，1990，1990（15）：9-14.

〔25〕腾建北，万德光，王孝勋.石斛名实及功效的本草考证[J].中药材，2013，36（11）：1876-1880.