大鼠梭形动脉瘤模型的制作研究

张连富，方兴根，李子付

(1.安徽省第二人民医院神经外科，合肥 230041；2.皖南医学院附属弋矶山医院神经外科，芜湖 241001；3.海军大学附属长海医院神经外科，上海 200433）

神经外科且破裂出血后梭形动脉瘤是颅内动脉瘤中比较少见，仅占颅内动脉瘤的3%-13%[1]。由于其特殊的形态导致治疗难度较大，虽然大量流行病学调查发现颅内动脉瘤形成的风险因素包括：年龄、男性、吸烟、高血压以及高血糖等[2]。但其形成、生长和破裂的发病机制仍然不是很明确。虽然有学者指出基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)与颅内动脉瘤密切相关，且可能在颅内动脉瘤形成、发展及其破裂过程中发挥重要作用[3]。国内早期也有细菌性颅内动脉瘤的报道[4]。但相关机制仍缺乏研究。而单独针对颅内梭形动脉瘤的研究也很少见。本研究主要利用猪胰弹性蛋白酶消化大鼠右侧颈总动脉制作梭形动脉瘤模型。并作出一些相关形态学和病理学的分析。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康SD大鼠40只，体质量250-300g，购自第二军医大学实验动物中心。随机分为正常对照组、0.9%氯化钠溶液对照组和实验组A、B，每组各10只。

1.2 动物模型制备 予术前12h禁食水，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.4ml/100g)后，沿颈前正中切口，充分暴露右侧颈总动脉，游离出颈总动脉，用外科手术使用无菌手套制作大小约5×15mm乳胶片，将制作好的乳胶片垫于游离出的颈总动脉下，两端用1号手术切口缝合线结扎形成一凹槽，限定凹槽长度为10mm，向该凹槽内注入来源于猪的胰弹性蛋白酶 (上海林叶生物科技有限公司)0.25（1.0U/μl），待消化 25min 后，吸干残留猪胰弹性蛋白酶后松开两端结扎线，用生理盐水反复冲洗数次后取出乳胶片，逐层缝合皮肤。对照组用0.9%氯化钠溶液代替猪胰弹性蛋白酶，操作步骤同实验组（图 1a、b、c、d）。

图1 1a SD大鼠正常右侧颈总动脉；1b乳胶片包裹右侧颈总动脉生理盐水消化中,动脉外膜无明显变化；1c乳胶片包裹右侧颈总动脉猪胰弹性蛋白酶消化中，可见动脉外膜逐渐透亮变薄；1d大鼠正常右侧颈总动脉猪胰弹性蛋白酶消化后，可见动脉局部膨胀，血管壁呈暗红色

1.3 影像学检查 实验组和对照组分别在7d、14d行腹主动脉数字减影血管造影（DSA）检查。术中取大鼠腹部正中切口，游离出腹主动脉，远端结扎，近端利用动脉瘤夹临时阻断，用4F的穿刺鞘插入腹主动脉后用1号线固定穿刺鞘头端。在微导丝的引导下将微导管行至主动脉弓，手推约2ml造影剂碘海醇，显示右侧颈总动脉形态。使用DSA机器(Philps Allura Xper FD20)自带软件测量形成的梭形动脉瘤长径、宽径以及正常动脉直径（图2）。

图2 2a SD大鼠正常颈总动脉造影图像；2b经猪胰弹性蛋白酶消化后14d动脉造影图像可见局部梭形突起（箭头所示）

1.4 组织学检查 实验组与对照组分别在7d、14d造影后灌注处死，取出右侧颈总动脉动脉瘤标本放入4%多聚甲醛固定24h以上，再行石蜡包埋切片行HE染色和弹力纤维染色。

1.5 统计学方法 统计学分析应用SPSS16.0统计软件，实验数据以均数±标准差表示，对每组数据进行正态性和方差齐性检验，方差经检验符合正态分布和方差齐性，组间两两比较应用两独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

采用简单的外科手法结合猪胰弹性蛋白酶局部消化包裹的大鼠右侧颈总动脉壁，术中可见血管壁逐渐变薄、透亮（图1c）。猪胰弹性蛋白酶消化25min后解除两端结扎线即可见两结扎线间动脉形成一段梭形凸起，动脉壁膨不规则的，搏动明显，血管壁呈暗红色（图1d）。

2.1 正常颈总动脉及生理盐水对照组解剖和病理学结果 正常对照组颈总动脉冠状切片HE染色内膜、中膜、外膜分层清楚，弹性纤维染色见弹性层丰富，以内弹力层最厚（图3a）。0.9%氯化钠溶液对照组术后7d、14d大体解剖显示右侧颈总动脉与周围组织无粘连，搏动正常，HE染色和弹性纤维染色显示血管结构正常（图 3d）。d、e、f弹力纤维染色。 3d（×40）显示生理盐水对照组颈总动脉弹力层完整；3e（×40）显示7d梭形动脉瘤模型弹力层变化明显；3d（×200）显示14d从交界处始弹力层逐渐变薄的过程。

图3 a、b、c HE染色（×40）。3a显示正常颈总动脉内膜、中膜、外膜结构完整；3b显示7天梭形动脉瘤模型交界处外膜逐渐减少，动脉管腔膨胀；3c显示14天梭形动脉瘤模型瘤腔处膜减少，内膜逐渐增生

2.2 对照组和实验组影像学表现 对照组和实验组大鼠在猪胰弹性蛋白酶消化前血管直径无明显区别。生理盐水对照组在消化25min后血管直径增大不明显，正常对照组和生理盐水对照组分别于7d、14d动脉造影，其中正常对照组平均值为（0.68±0.04）mm，生理盐水对照组直径平均值为（0.69±0.03）mm。实验组在消化 25min后及 7d、14d比对照组的血管直径明显增大，7d造影检查测量动脉瘤宽径平均值为（1.37±0.02）mm。14d造影检查测量动脉瘤宽径平均值为（1.39±0.03）mm。实验组术后7d、14d造影的动脉瘤宽径与正常对照组和生理盐水对照组的比较运用配对样本T检验P＜0.05，差异有统计学意义。实验组术后7d、14d造影的动脉瘤宽径的比较运用配对样本T检验P＞0.05，差异无统计学意义。

2.3 实验组术后7d、14d解剖和病理学结果 实验组术后7d、14d大体解剖显示右侧颈总动脉与周围组织轻度粘连，颈总动脉局部形成梭形凸起，搏动明显。HE染色显示动脉瘤外膜破坏，动脉管腔明显膨胀（图3 b、c）。弹性纤维染色显示载瘤动脉的弹力层在动脉瘤颈处逐渐减少变薄，动脉瘤内膜逐渐增生，但仍缺乏弹力层，胶原纤维增生明显（图 3e、f）。

3 讨论

近年来国外学者开始尝试利用弹性蛋白酶结合一定外科操作来制作实验鼠动脉瘤模型[5]。也有学者应用外科手法和弹性蛋白酶在家兔体内制造出具有挑战性的梭状动脉瘤[6]。Hosaka[7]将注入大鼠的基底池制作出颅内动脉瘤破裂模型，评估弹力层破坏、炎症细胞和巨噬细胞浸润、内膜内皮细胞缺失和动脉瘤壁平滑肌层增厚，可用于研究脑动脉瘤的形成、破裂和治疗国内也有学者使用猪胰弹力蛋白酶消化兔颈总动脉外膜使颈总动脉呈梭形扩张，并造成颈动脉内膜损伤有效地制作出梭形动脉瘤模型[8]。Reinald等[9]利用弹力酶消化兔的颈总动脉，成功地诱导出了梭形动脉瘤，并指出弹力酶的浓度对血管壁的影响。

在对实验动脉动脉瘤模型的形态和病理学观察时间的选择上，我们参考了Lee等[10]研究发现弹力酶诱导鼠动脉瘤模型2-3周组织的病理学即发生改变。而大鼠的血管造影只能选择腹主动脉穿刺，且造影后无法继续存活，故对该梭形动脉瘤模型的形态变化在多时间点的跟踪测量上存在较大困难。综上，我们选择分别在1周和2周对大鼠进行动脉血管造影和灌注取材。发现经过1周和2周的血流冲击，大鼠的颈总动脉梭形动脉瘤在形态学上趋于稳定，但组织学上却存在很大差异，7d时弹力纤维染色可见弹力层从交界处始变薄，14d时弹性纤维染色可见动脉瘤壁表面由少细胞胶原成分覆盖，结构也较7d时更为完整。

虽然在造模时我们也限定了该梭形动脉瘤模型的长度，但实验组A和B在各时间点内的动脉血管造影显示梭形动脉瘤模型的长径存在差异较大，考虑造模过程中不能排除一定的猪胰弹性蛋白酶外溢可能，故本实验对该梭形动脉瘤模型的长径不做进一步统计学分析。两个时间点的梭形动脉瘤模型的宽径较对照组发生显著变化，说明在血管外膜以及弹力层损伤的情况下，随着血流动力学的作用，动脉瘤宽径明显增大，能够形成较为稳定的梭形动脉瘤。而两个时间点的梭形动脉瘤宽径比较则无统计学意义，有可能与动脉损伤后的自我修复以及实验时间点的跨度选择等相关，仍需要进一步实验研究分析。该动脉瘤模型在1周和2周的观察过程中有类似于人类颅内动脉瘤的自发性生长过程,在血管腔内持续的高应力作用下，膨胀性生长是否具有破裂可能，以及长期开放的病理生理和影像学改变都有待更长期随访研究,但该造模方法易于操作，实验成功率也较高，同时实验费用也较低，梭形动脉瘤模型经过7d和14d的动脉血管造影观察发现形态较稳定，能够形成较成功的梭形动脉瘤。病理学观察该梭形动脉瘤模型在结构上类似于人类的颅内梭形动脉瘤,适用于梭形动脉瘤的形成机制和病理学研究。