牛种布鲁氏菌病疫苗的研究进展

李亚杰

河南省周口市动物疫病预防控制中心，河南周口466000

1 布鲁氏菌病概述

布鲁氏菌是一种革兰氏阴性兼性细胞内寄生菌。布鲁氏菌病（布病）是由布鲁氏菌引起牛、羊、猪、鹿、犬等哺乳动物和人类共患的一种动物源性传染病，我国将其列为二类动物疫病。布病的传播主要通过与血液、被感染宿主动物的粪便、尿液和胎盘的密切接触，或通过吸入被污染的灰尘或气溶胶。布病的典型症状是怀孕母畜流产，乳腺炎也是常见症状之一；公畜往往发生睾丸炎、附睾炎或关节炎；而人类感染布病多表现为持续性感染、波浪热、多汗和关节痛等，而且可能复发或留下后遗症。在地方病流行地区，接种疫苗是控制和消灭布鲁氏菌病最经济和最关键的方法，也能最大程度地降低人感染的风险。

2 牛种布鲁氏菌疫苗概述

2.1 经典的弱毒活疫苗

S19 疫苗是在家畜中使用最广泛的流产布鲁氏菌疫苗，又称作A19 疫苗。S19 菌株是强毒株在室温培养1年意外分离得到的光滑型突变菌株，其中有一段720 bp 序列缺失，导致赤藓糖醇分解代谢基因被破坏，与原代菌株相比，其毒力较低[1]。S19 疫苗接种可诱导相对较高的免疫原性，保护期较长，几乎可达到对整个生产期的保护。小鼠动物模型研究显示，可产生较高水平的IFN-γ、CD4+和CD8+[2]。然而，S19 疫苗也有一定的副作用：干扰布鲁氏菌血清学诊断试验；导致怀孕母畜流产，降低产奶量；而且对人类具有一定的致病性。RB51 疫苗菌株是一种耐利福平突变体，最初通过牛种布鲁氏菌2308 在含青霉素和利福平的培养基多次传代培养分离筛选得到的粗糙型菌株。研究表明，编码O 侧链合成必需的糖基转移酶wboA基因在2308 菌株通过连续传代培养后缺失[3]。RB51 疫苗菌株较为稳定，无残余毒力和毒力返祖的可能性，不干扰血清诊断试验，可预防流产；若使用全剂量仍会导致怀孕母牛的流产，而且保护率低。此外，尽管RB51 疫苗的减毒程度更高，但它对人类依然具有传染性，而且，它具有利福平抗性，不利于人类布鲁氏菌病的治疗。

2.2 亚单位疫苗

目前用于布鲁氏菌亚单位疫苗进行研究，包括重组肽、蛋白质、DNA、脂多糖（lps）和外膜囊泡（omvs）。与传统的弱毒活疫苗相比，亚单位疫苗安全性高、无残留毒力，可用于人类和怀孕动物。但保护率较低，需要高效免疫佐剂加强免疫效果。T 细胞抗原诱导分化的Th1 反应是主要的免疫应答，可增强亚单位疫苗的保护作用。其中，作为蛋白质亚单位疫苗的OMp16、OMp19，脂质体蛋白L7/L12、OMp25、p39 和AsnC，促进Th1 型免疫应答，和S19疫苗保护水平相当。相反，二氢硫辛酰胺琥珀酰转移酶（rE2o）和半胱氨酸合酶A（rCysK）亚单位疫苗引发Th2 型免疫应答，保护力相对较低。SurA 和DnaK（热休克蛋白70 家族）作为蛋白质亚单位疫苗，与经典活疫苗S19 相比，保护力较低。将重组蛋白混合物（rOMP19+rp39）接种小鼠可诱导Th1 介导的同型抗体和细胞免疫应答，对牛种布鲁氏菌544菌株产生保护力。OMp19 和p39 结构域组成的嵌合亚单位蛋白疫苗接种小鼠模型后，产生与Th1 型免疫反应相关的IgG 2a 和细胞因子，并诱导二次免疫应答。OMP25-BLS 融合蛋白和热休克蛋白60 ku，以壳聚糖纳米粒为载体制备的亚单位疫苗，对其免疫效果进行了评价，发现二者结合使用诱导的细胞免疫应答高于单独使用时。布鲁氏菌保守重组蛋白OMP25c 与弗氏佐剂混合可诱导Th1 和Th2 型免疫应答，与S19 保护水平相当。其他的重组蛋白如：AspC、Dps、lnpB 和Ndk 作为亚单位疫苗，可诱导产生高水平的IgG2a，与RB51 的保护效果相当。以DNA 为基础的另一种亚单位疫苗能在多次免疫后诱导体液和细胞免疫反应。牛种布鲁氏菌基因组岛3（GI-3）区域编码的几个开放阅读框（ORF），其表达的抗原对细胞内生存和机体的发病机制起重要作用。因此，基于GI-3 区域设计的布鲁氏菌DNA 疫苗可能是一种有效的候选疫苗。编码GI-3 区域的BAB1-0263 或BAB1-0278 基因的DNA 疫苗，可刺激体液和细胞免疫，并产生高水平的IFN-γ。此外，表达BAB1-0278 基因的DNA 疫苗可以对感染2308 菌株产生保护力。评价GI-3 区域含ABC 型转运体（pV278a）的DNA 疫苗发现，可显著增强Th1免疫应答，并产生高水平的IgG2a。Gomez 等人构建的含BAB1-0273 和/或BAB1-0278 和SOD C基因的多价融合DNA 疫苗，可产生细胞免疫和体液免疫，IFN-γ、抗体和Th1 型反应，然而保护力低。编码SOD-Cu/Zn 和IL-2 融合蛋白的DNA 疫苗，可诱导产生IgG2a 和TNF-α，与RB51 疫苗相比，可对2308 菌株产生有效保护[4]。

2.3 基因工程弱毒活疫苗

利用分子生物学技术敲除牛种布鲁氏菌毒力基因，可导致明显的衰减，正在开发的研究包括：嘌呤生物合成途径基因，铁螯合酶hem H 突变体，脂质A 脂肪酸转运基因，磷酸甘油酸激酶编码基因，IV 型分泌virB基因和LPS 生物合成途径基因。这些突变体的保护水平与经典减毒活疫苗相似。Ugalde 等人通过缺失2308 菌株的磷酸葡萄糖变位酶（pgm）基因，研制了一种无血清诊断干扰的重组菌株，将光滑型改变成粗糙型，且Th1 免疫应答和S19 相当。将RB51 菌株cyd C cyd D 和cyd C pur D 基因进行单、双基因缺失的疫苗，与RB51菌株相比，单剂量接种对小鼠的保护力较低，加大剂量即可诱导体液和细胞免疫反应，还可产生更高水平的保护力，对牛的免疫评价还需进一步验证。牛种布鲁氏菌野外分离株（BA15）中也进行相同的双重缺失，可提供相同的保护效果，但不需要加大剂量进行疫苗接种。缺失外膜融合蛋白OMP19基因的靶向突变体在小鼠模型中保护期较短，但疫苗评价显示和S19 和RB51 的保护水平相当。甲酰基转移酶（wbk C）基因（参与脂多糖生物合成的关键基因），缺失后形成了粗糙型突变体，与光滑的S19菌株相比，衰减更大，对小鼠的保护性免疫力更低。糖基转移酶wad C基因的缺失产生的突变体，不能有效逃避宿主免疫的检测，免疫小鼠后可产生类似于S19 菌株的保护水平。和S19 相比，布鲁氏菌wzm和wzt基因的破坏导致免疫功能下降[4]。

2.4 活载体疫苗

布病活载体疫苗主要是将布鲁氏菌保护性免疫抗原整合到另一种载体病毒或细菌基因组中，如小肠结肠炎耶尔森菌编码细菌铁蛋白（BFR）或P39诱导Th1 型免疫应答。人苍白杆菌和乳酸乳球菌表达SOD 在小鼠模型免疫中产生保护力。沙门氏菌表达31kDa、BCSP31、SOD、OMP3b、OMP 19、L7/L12、BLS 和prp A 对小鼠、豚鼠、山羊可产生坚强的保护力且安全性高。重组牛痘病毒表达L7/L12、OMP18在小鼠模型中保护力不显著。Semliki 森林病毒（SFV）编码IF3 和Sod C 接种小鼠后保护力不如RB51。流感病毒表达L7/L12 和OMP16 作为载体开发的疫苗，与S19 相比，安全性较高，可长期刺激体液和细胞免疫，尤其是在怀孕的小母牛身上防止感染；另外，通过添加OMP19 和SOD 蛋白来改进这种疫苗配方，以蒙脱石凝胶为佐剂，对绵羊和山羊有良好的保护作用。表达p39 和BLS 的腺病毒作为载体在小鼠模型中可引起体液和细胞免疫。RB51 过表达SOD、wboA、L7/L12 作为疫苗研发，和亲本菌株RB51 相比、保护力显著提高；RB51 表达异源抗原大肠杆菌β-半乳糖苷酶和牛分枝杆菌65 ku 热休克蛋白，小鼠免疫后可诱导产生IgG2a 和IFN-γ[4]。