神经性疼痛的治疗新方向：光遗传学

王倩文综述 王龙，王晞审校

大规模流行病学调查结果显示，具有神经病理特征的慢性疼痛患病率估计为7 %～10%[1]。由于全球人口老龄化、糖尿病发病率增加和癌症化疗后存活率提高，神经性疼痛的发病率可能会进一步增加。此外，神经性疼痛患者常伴有严重的睡眠障碍、焦虑和抑郁，严重影响了患者的生活质量[2]。神经性疼痛的发生与多基因起源、多细胞和分子靶点有关，难以诊断引起持续疼痛症状的确切原因，且尚无适宜的治疗方案。值得注意的是，神经性疼痛主要归因于神经元或免疫细胞的异常活动，高度选择性的光遗传技术有望抑制异常疼痛信号的传递，达到治疗目的。文章介绍了光遗传学、神经性疼痛的发病机制，并阐述了光遗传学在治疗神经性疼痛中的应用，讨论了其优势和可能性，旨在为以后的研究提供理论依据和治疗方向。

1 光遗传学概述

光遗传学是一种利用光控制或监测神经活动的技术，通过光敏离子通道(视蛋白)调节特定神经元亚群的活动。如利用通道视紫红质(ChR)、盐视紫红质(NpHR)等光发生激活剂来控制神经元。嵌合离子通道在特定的细胞类型中表达，通过转基因方法选择性地刺激特定神经元群，将光纤插入到所需的位置从而将光传递给神经元。由于神经性疼痛是由复杂的、整合的神经元通路及电路介导调节，因此光遗传学有望成为研究神经元机制和神经基质的一个有价值的工具。

1.1 光遗传激活 光遗传学的激活是指视蛋白捕获光并以此主动泵送离子穿过细胞膜或打开通道，使得离子被动地穿过细胞膜从而调节特定神经元活动。工程化地将视蛋白表达到非光敏细胞中能够快速实现光学控制特定的细胞过程。因此光遗传学可提供高速激活和沉默。

微生物视蛋白是主要类别的光敏蛋白，根据膜电位进行分类。来自莱茵衣藻的ChR被设计成对阳离子进入具有选择性，而NpHR对阴离子通量具有选择性，引起超极化。质子泵如细菌视紫红质、蛋白质视紫红质和古视紫红质也通过从细胞质中释放出质子而影响超极化。它们照射模式的差异允许去极化和超极化的视蛋白在细胞系统中共表达并使系统双向化[3]。另一类光激活视蛋白是嵌合受体，其模拟各种信号传导级联。例如光活化膜整合的G蛋白偶联受体，与视紫红质的细胞外结构域和特定肾上腺素能受体的细胞内区域的杂合受体，如Gq偶联的人α1a-肾上腺素能受体和Gs偶联的仓鼠b2-肾上腺素能受体，分别制造optoa1AR和optob2AR[4]。简单的结构、快速的动力学和单个细胞内双向控制的可能性使这些蛋白质成为光遗传学中新颖和经典的工具。简而言之，视蛋白具有独特的性质，如特定离子的选择性、吸收光谱、亚细胞定位和对光的敏感性。

1.2 光遗传特异性调节 光遗传学技术最有利的方面之一是高度的细胞特异性。这是通过战略性地使用细胞特异性启动子来调节视蛋白基因在转基因动物中的转录，或使用病毒载体和位点特异性显微注射来实现的。常见的启动子包括人类突触素1或细胞表面抗原Thy1的启动子等。对于抑制性神经元的特异性表达，可以使用在所有GABA能神经元中表达的谷氨酸脱羧酶启动子或使用生长抑素和parvalbumin启动子靶向抑制性神经元亚型。而钙调蛋白激酶Ⅱα启动子可以用来限制视蛋白表达神经元兴奋性,特别是大脑皮质结构。目前开发的一种新系统允许Fos阳性神经元中视蛋白的表达，称为活性人群中的靶向重组[5]。该系统可只对在特定事件中活跃的神经元进行操作，进一步提高了光遗传学的特异性。此外非神经元细胞类型也可通过光遗传学进行靶向，包括当启动子受到胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子调控时的星形胶质细胞。这种对特定细胞进行特异性操作的能力，能够更好地理解神经元和神经胶质细胞在神经性疼痛中的作用。

2 神经性疼痛发病机制

神经性疼痛是指由躯体感觉系统的损伤或疾病引起的疼痛。病因多种多样，包括创伤、炎性反应、代谢性疾病，如糖尿病、毒素、病毒感染或恶性肿瘤等。在神经损伤形成后，痛觉神经纤维在多个水平发生剧烈变化，如细胞膜上新的受体和离子通道的基因轮廓改变，外周和中枢神经系统伤害性信号处理的改变等，使感觉信号进入脊髓和大脑发生改变及紊乱，最终导致神经性疼痛。疼痛信号的传递受兴奋性和抑制性神经网络及配体—受体的巨大复杂性调节[6]。在疾病中，即使没有有害刺激，长时间的组织损伤或炎性反应也会引起基因表达和膜蛋白修饰的改变，从而导致某些痛觉受器的异常激活。

2.1 神经元活动异常 原发性传入神经纤维的异位活动在周围神经损伤后神经性疼痛的病理生理学中可能起关键作用。实验人员通过探究无神经损伤、慢性压迫损伤和脊髓神经结扎等多种动物模型后，报道了传入神经纤维在神经性疼痛启动和维持中持续兴奋。同样，有髓神经轴突(A纤维)和无髓神经轴突(C纤维)特异性的变化在疼痛模型中也有大量报道,如频率、类型和异位放电持续时间增加[7]。这些神经纤维放电的变化导致神经性疼痛。而在进行周围神经阻滞治疗后，外伤性周围神经损伤患者同侧自发性和诱发性疼痛完全消失，这提示阻断受损神经元异常活动可用于治疗神经性疼痛。硬膜外注射利多卡因阻断背根神经节也可减轻幻肢痛患者的疼痛感[8]。此外，随着持续的伤害性输入，伤害性神经通路对刺激变得敏感，即痛觉神经元对其正常或阈下传入的响应性增强。小胶质细胞的过度激活同样会触发促痛介质的释放，导致疼痛状态的持续[9]。由于神经损伤后产生神经性疼痛的机制错综复杂，从源头阻断受损神经元异常活动可能是简单有效的治疗方法，例如光遗传学技术。

2.2 受体及离子通道改变 神经性疼痛患者中，神经元特性的改变可能与细胞内离子通道(钠、钙和钾)改变相关。离子通道表达的变化可导致疼痛信号的传入神经元及其轴突过度兴奋，且钠离子通道和钙离子通道还可促进神经递质释放，共同作用导致疼痛。既往研究人员发现敲除小鼠背根神经节(DRG)神经元中的钠离子通道可以减轻炎性反应性疼痛和痛觉过敏。而且还观察到神经瘤内受损神经远端轴突尖端存在Na+异常积累，产生了异位冲动[10-11]。G蛋白偶联的内整流钾(GIRK)通道是疼痛信号的重要参与者，并作为阿片类药物镇痛作用的效应器发挥重要作用。另有多项研究表明，在神经性疼痛动物模型中钾离子通道表达下调[12]。在神经性疼痛模型中，DRG神经元中的钙离子通道电流密度上调,成功敲除钙离子通道可以介导镇痛效果。离子通道的表达和功能极大控制了疼痛信号通路中初级传入神经元的电活动，因此有目的地干预离子通道，有助于治疗神经性疼痛。

2.3 G蛋白偶联受体改变 G蛋白偶联受体在神经性疼痛患者体内大量表达，提示其在神经性疼痛的发生发展中起重要作用，主要可能与痛觉感受器敏化相关。与离子通道短效作用相比，G蛋白偶联受体可介导基因表达或膜兴奋性的长期变化。此外，神经损伤后激活免疫细胞涉及了许多经典趋化因子和趋化因子的G蛋白偶联受体[13]。G蛋白偶联受体的激活同样会引起炎性介质的释放，免疫细胞、炎性因子及各种G蛋白偶联受体的受体激动剂共同作用于痛觉感受器上的G蛋白偶联受体，造成疼痛[14-15]。

3 光遗传学在神经性疼痛治疗中的应用

光遗传学通过在特定的细胞类型中过度表达光敏蛋白(视蛋白)来产生神经回路特异性调节。与传统电刺激相比，光遗传学对神经元刺激的明显优势包括以毫秒为时间精度选择性激活特定神经元。这种光敏细胞刺激方法消除了将电极放置在具有相对同质神经元组的脑细胞核中这一极具挑战性的要求。针对神经性疼痛涉及的发病机制，光遗传学可从不同途径缓解治疗神经性疼痛。

3.1 中央脑部区域 光遗传学可使大脑区域内的离散神经元群实现可逆的功能增益或功能损失。痛觉系统的中枢敏感和皮质超兴奋是神经性疼痛的基本机制之一。Xiong等[16]用光遗传学配合光刺激改变了神经元膜的性质和降低兴奋性突触后事件的频率，使皮质超兴奋性正常化，减少并预防了疼痛。Gadotti等[17]证实光遗传学技术也可通过调节内侧前额叶皮质(mPFC)的功能来治疗神经性疼痛。他们向基底外侧杏仁核(BLA)中注射腺相关病毒(AAV)-Arch3.0构建物，然后将纤维光学套管植入mPFC，并测量黄光介导的这种抑制视蛋白激活时的疼痛行为反应。数据显示，Arch3.0激活分别导致爪退缩阈值和对机械刺激和热刺激的反应延迟显著增加，这可能是BLA向mPFC中GABA能神经元突触输入的改变所介导的。此外，最近的人类成像研究表明，在慢性疼痛中前额皮质(PFC)到伏隔核(NAc)的投影发生了改变。在大鼠持续性神经性疼痛模型中，PFC的光激活会产生强烈的抗伤害感受效应，从而减轻疼痛症状，而PFC的疼痛缓解功能可能是通过对NAc的投射介导的。另一项实验同样报道了光刺激NAc改善了大鼠的疼痛行为和降低丘脑后外侧核的丘脑放电[18]。此外，利用光遗传学可抑制前扣带皮质(ACC)的过度活动以减轻神经性疼痛和类似焦虑抑郁的后果[19]，治疗神经性疼痛的同时改善抑郁症状，提高患者生活质量。因此借助光遗传学刺激大脑特定区域可能是缓解和治疗神经性疼痛的一种新策略。

3.2 周围神经元 周围神经损伤及神经元异常活动参与了神经性疼痛的致病，有大量数据显示，利用光遗传学选择性地影响特定神经元可以有效缓解神经性疼痛。Dhandapani等[20]及团队选择性地用光激活一些外周神经元，发现小鼠产生明显的伤害性行为。后利用基于TrkB配体的光治疗方法，对这些神经元进行分子引导激光消融，实现皮肤TrkB阳性神经元的长期收缩，并成功逆转了神经性疼痛。此外，有研究者发现体内的GABA能神经元的光发生去极化同样可以减少周围神经的痛觉[21]。Watanaba等[22]微注射AAV来表达通道视紫红质-2 (ChR2)，使多巴胺能神经元受到光刺激，这些细胞的光激活在神经性疼痛模型小鼠中产生了一种显著但短暂的镇痛效应。而Raver等[23]发现在大鼠神经性疼痛模型中肱旁复合体(PB)神经元活动增强，这与来自CeA的对侧臂旁神经(LPB)抑制有关，并且他们也通过光刺激这一途径成功抑制了疼痛。Cowie等[24]则通过光遗传学选择性地表达向外整流质子泵archaerhodopsin3 (Arch)，并使用透皮光激活Arch来抑制神经性疼痛模型中的周围皮肤末梢，阻断了表达降钙素基因相关肽- α外周神经元(CGRPα)的信号，成功降低了疼痛反应。这些结果均提示通过调节神经损伤后的异常神经元活动这一途径，光遗传学有望成为治疗神经疼痛的有效方法之一。

3.3 离子通道 离子通道是疼痛产生的重要参与者。鉴于神经性疼痛的致病通路十分复杂，研究人员认为直接作用于周围痛觉感受器的终端，阻断疼痛信号传导，是治疗神经性疼痛的一条简单有效的方法。有学者将抑制Arch质子泵送到Nav1.8(+)主传入血管，利用黄光刺激可靠地阻断了背根神经节神经元(DRG)的电诱导动作电位。实验结果显示Nav1.8-Arch(+)小鼠的后爪急性透皮光照可显著降低炎性条件下的机械异位痛。此外，对麻醉的Nav1.8-Arch(+)小鼠外周传入神经长时间光学沉默可导致刺激后镇痛[11,25]。然而，目前可用的光发生抑制工具仅提供了短期的神经元沉默，不能提供长期抑制。有研究者提供了一个优化的蓝光敏感合成钾离子通道BLINK2，它在3个物种的神经元中都有良好的表达。这个通道被低剂量的蓝光照射激活，并在照明停止后黑暗中保持活跃(数十分钟)，而这种激活引起了长时间的神经元放电抑制。作为一个概念验证的应用，研究者在一个自由移动的大鼠神经病理性疼痛模型中证明，少量BLINK2通道的激活导致了疼痛感觉的长期减少(30 min)[26]。此外，利用光敏第三代氯离子泵(eNpHR3.0)抑制痛觉感受器的动作电位生成。当通过AAV6肝内注射给药时，eNpHR3.0在恒定的黄光照射下激活DRG神经元，强烈抑制膜超极化引发的动作电位。该通道的体内刺激足以防止神经性疼痛模型中的疼痛行为，表明其治疗潜力。

综上所述，光遗传学有望通过不同机制来达到治疗神经性疼痛的目的。但需要注意的是，光遗传学用于神经性疼痛治疗的真正挑战是确定损伤的伤害性神经元，而将其用于神经性疼痛治疗的另一个主要障碍是光敏蛋白传递给目标细胞。通常通过病毒基因递送方法将光敏蛋白引入靶向哺乳动物神经元[27]。而Dine等[28]已经充分描述了人类中病毒载体递送系统的限制。最近研究发现，非侵入性经颅聚焦超声技术可通过全身注射基于脂质的微泡(由超声造影剂组成的混合物)和感兴趣的分子来靶向血脑屏障[29]。利用这一技术，可以递送编码各种光活化蛋白质通道的病毒载体，是体内允许完全非侵入性的神经刺激。此外，最近一项实验通过克服所需恒定照明的需要，证明了阶梯功能抑制通道视紫红质SwiChR优于正常通道视紫红质，这种策略将所需的光照暴露降低>98%，因此有望解决光遗传抑制的长期限制。optoPAIN作为一种非侵入性评估疼痛敏感性变化的光遗传平台，同样可用于检查疼痛的药理学和化学抑制[30]。

4 小结与展望

目前治疗神经性疼痛的局限之一是对所涉及的神经生物学和神经回路的尚未完全理解。将光遗传学的细胞特异性和时间控制与体外电生理记录相结合，可更容易地梳理出特定通路和电路中的神经元之间的通信。并且光遗传学利用基因识别周围感觉纤维亚群，具有高时间分辨率，克服了遗传消融的代偿限制。而且在动物模型上，已有许多实验提供了光遗传学通过作用于大脑区域、外周神经元、受体及离子通道改变和G蛋白偶联受体等途径成功治疗神经性疼痛的证据。此外，光遗传学作为学界一个新领域，其技术和研究正在不断开展深入。鉴于神经性疼痛尚缺乏有效治疗手段及其病理生理机制仍未阐明，具有高度特异性的光遗传学应成为未来治疗方法的主要焦点之一。