间充质干细胞治疗急性呼吸窘迫综合征作用研究进展

2020-02-16张海月刘潺综述吴小军审校

疑难病杂志 2020年10期

张海月，刘潺综述吴小军审校

急性呼吸窘迫综合征(ARDS) 是急性肺损伤(ALI) 最严重的形式，是在多种原发病和诱因作用下发生的急性缺氧性呼吸衰竭综合征[1-2]。肺部感染，尤其是细菌性肺炎是常见的病因;另外，脓毒血症、全身炎性反应综合征(SIRS)、吸入性肺炎、创伤、大量输血、重症坏死性胰腺炎等也是诱发ARDS的危险因素。当肺组织受到上述损伤因素刺激时，肺泡毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞受损，内皮屏障通透性增加，液体外渗至肺间质和肺泡腔，引起肺泡和肺间质水肿，同时肺泡表面活性物质生成减少、透明膜形成，引起肺顺应性下降，通气/血流比例失调。TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等促炎因子释放，促进中性粒细胞向肺部损伤部位募集并激活，释放活性氧、蛋白酶、白三烯等介质，破坏毛细血管内皮和肺泡上皮、收缩支气管、堵塞小气道。另外炎性反应细胞的增生和纤维化阶段，增加了肺泡—毛细血管膜的厚度，导致弥散功能障碍，进一步加重低氧血症。目前，人们对ARDS发病机制有了更深的了解，同时机械通气及支持疗法也有了很大的进步，但是ARDS的病死率仍高达30%～50%。因此，新的治疗措施亟待提出。近年来，很多研究报到了间充质干细胞(MSCs)治疗肺部疾病的潜力[3-5]。MSCs可以通过细胞接触依赖性机制和释放可溶性因子发挥作用，表现为抗炎、抗凋亡、促进内皮及上皮细胞修复、增强微生物及肺泡内液体清除等过程，改善了ARDS动物模型的肺功能及生存率。另外MSCs 表面表达低水平Ⅰ型人类白细胞抗原(HLA)，不表达Ⅱ型主要组织相容性抗原(MHC-Ⅱ)和T细胞共刺激分子，具有低免疫原性，为同种异体MSCs治疗提供理论依据[6]。部分早期临床试验也提供了MSCs用于治疗ARDS患者安全性的证据。

1 MSCs概述

MSCs 为成体干细胞，最早从骨髓中分离出来，具有增殖分化能力，产生成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞各种间充质表型。2006年，国际细胞治疗学会间充质干细胞与组织干细胞委员会提出定义MSCs的最低标准：(1)在标准培养条件下对塑料器皿的黏附性；(2)必须表达CD73、CD90和CD105表面分子，不表达CD11b、CD14、CD34、CD45、CD79和HLA-DR;(3)能够在体外分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞。目前，MSCs不仅可从骨髓中获得，还可以从脂肪组织、肺组织、脐带血、胎盘等其他几种组织中分离[7]。不同来源的MSCs其基因表达、分泌物质和细胞表面蛋白具有异质性，从而影响其免疫调节作用[8-10]。与胚胎干细胞相比，MSCs有更低的致瘤性，可在体外迅速增殖，有更大的临床应用潜力。MSCs还可在无需宿主与受体的匹配条件下发挥免疫调节作用，因此可用于自体或异体移植的抗排斥治疗。多项试验研究表明，MSCs在心肌梗死、糖尿病、肝功能衰竭和急性肾功能衰竭等临床疾病中可能具有潜在的治疗应用。动物实验研究也表明MSCs可能对ALI、ARDS有治疗作用。

2 MSCs治疗ARDS作用机制

MSCs迁移定植到肺损伤部位后，可在体内分化成血管内皮细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞，参与肺泡上皮的更新。但在LPS诱导急性肺损伤的动物实验中发现，MSCs的治疗作用并不依靠MSCs分化成肺泡或气道上皮细胞、纤维细胞和内皮细胞等任何一种细胞类型，可能与MSCs向损伤部位募集，通过与宿主细胞相互作用并分泌多种可溶性分子来实现[11-12]。MSCs可分泌生长因子、抗炎因子、调节上皮和内皮通透性的因子等多种物质作用于肺损伤部位，还可以分泌外泌体、微囊泡，将线粒体转移到肺泡减轻肺部损伤，促进组织修复[13-14]。

2.1 MSCs调节内皮和上皮细胞通透性微血管内皮细胞完整性是维持内皮屏障稳定性的重要因素。内皮屏障通透性增加，液体外渗，上皮细胞损伤肺泡表面活性物质减少，肺组织水肿和弥漫性炎性反应是ARDS主要表现。MSCs分泌的部分物质具有调节肺泡微血管系统通透性的能力。血管生成素1(Ang-1)是内皮Tie2受体的配体，具有调节上皮细胞通透性，保护上皮细胞屏障作用。炎性环境下培养MSCs可增强其产生Ang-1的能力，当siRNA沉默Ang-1表达时，MSCs失去对上皮细胞通透性的调节能力。角质细胞生长因子7(KGF-7)在内皮细胞再生和损伤修复中有重要作用，可减轻ALI动物模型的肺泡水肿。过表达KGF-7的MSCs改善了微血管通透性，抑制了TNF-α、IL-1β等促炎因子的释放，增加了抗炎因子IL-10释放[15]。肝细胞生长因子(HGF)能够保护细胞间紧密连接，维持内皮屏障[16-17]。另外，MSCs分泌的血管内皮生长因子(VEGF)通过降低内皮通透性、抑制内皮细胞凋亡、抑制炎性反应，发挥对ALI动物模型的保护作用[18-19]。

2.2 MSCs抗炎作用研究表明，MSCs能够分泌白细胞介素1受体拮抗剂(IL-1RA)、KGF等多种因子发挥抗炎作用[20-21]。MSCs能够抑制内毒素诱导ALI模型血液循环及肺组织内促炎因子IFN-γ、IL-1β、MIP1-α、KC的产生。研究表明MSCs 降低了内毒素诱导ALI模型肺泡灌洗液中性粒细胞数，增加了表达(iNOS)-Ym1+的M2型巨噬细胞的比例，机制可能与MSCs分泌的胰岛素样生长因子1(IGF-1)促进巨噬细胞向M2表型转化，抑制内毒素诱导的炎性反应有关[22]。

2.3 MSCs的免疫调节作用 MSCs能够影响树突状细胞的成熟，增强巨噬细胞、中性粒细胞的吞噬能力，促进巨噬细胞向M2表型转化[23-26]。MSCs分泌的前列腺素E2(PGE2)能够促进单核巨噬细胞分泌抗炎因子IL-10，从而抑制了中性粒细胞的黏附、跨上皮转移，对炎性反应起到抑制作用[27]。MSCs分泌的KGF促进了GM-CSF生成，增强了肺泡巨噬细胞的吞噬功能，KGF还能通过增加抗凋亡因子Bcl-2、降低凋亡相关因子Bax及Caspase-3的表达，抑制巨噬细胞的凋亡[28]。MSCs还能抑制B淋巴细胞增殖分化，抑制T淋巴细胞增殖，增加Treg细胞分化，抑制Th17分化[29-30]。MSCs分泌的吲哚胺2，3双加氧酶(IDO)和KGF6是其发挥免疫调节作用的重要分子。IDO通过耗竭色氨酸并生成犬尿氨酸，从而抑制T细胞增殖。MSCs上调与IL-8结合的KGF6，发挥抗炎作用。MSCs除了分泌抗炎因子外，还能促进IL-6、IL-8的产生。IL-6、IL-8为促炎因子，但有研究表明抑制MSCs IL-6的表达，降低了其对肺损伤的保护作用，另外IL-8可增强VEGF表达，促进血管生成[31]。

2.4 MSCs提高肺泡液清除率肺泡液清除率(AFC)是肺泡上皮细胞通过钠离子通道、水通道蛋白、Na-K-ATP酶清除肺泡水肿液的能力。AFC下降对ARDS的病死率有预测价值。在高气道压力机械通气、细菌感染、促炎因子释放等情况下可引起AFC降低。MSCs可通过KGF依赖途径改善LPS诱导的AFC下降，KGF主要促进钠转运蛋白向肺泡上皮细胞表面转运来增加肺泡液的清除。KGF还能降低水通道蛋白5的表达并抑制Ⅱ型肺泡上皮细胞向Ⅰ型转化。也有研究表明，KGF对AFC的调节作用是通过增加上皮细胞修复、细胞黏附和迁移来实现。

2.5 MSCs增强微生物清除作用 MSCs通过分泌抗菌肽和增强巨噬细胞吞噬作用减轻细菌性脓毒血症。MSCs受到细菌刺激后可分泌β防御素BD2、抗菌肽LL-37和Lipocain 2。BD2能够抑制细菌生长，LL-37有抗细菌、抗真菌、抗病毒作用，Lipocain 2在肺部感染时能够调节CXCL9等趋化因子表达，减轻炎性反应[32-34]。MSCs条件培养液(conditioned media, CM) 中含有高浓度抗菌肽能够抑制细菌生长。肺损伤的动物实验中，MSCs可抑制动物肺组织匀浆液中细菌生长，而LL-37抗体抑制了这一作用；通过TLR2、TLR4抗体抑制BD2的生成，同样降低了MSCs的抑菌作用[20,32]。

2.6 MSCs线粒体转运作用 MSCs能够恢复上皮细胞线粒体功能。研究表明，MSCs能够通过MSCs和上皮细胞间connexin- 43-gap连接蛋白转运线粒体到损伤的上皮细胞，为上皮细胞提供ATP，增加Ⅱ型肺泡上皮细胞分泌肺泡表面活性物质表达，减轻肺损伤。MSCs还能通过形成纳米管道将线粒体转移到巨噬细胞，从而增强巨噬细胞氧化磷酸化和吞噬功能。

3 MSCs治疗ADRS的实验研究及优化治疗策略

大量的动物实验表明，MSCs对肺损伤有治疗作用，尽管MSCs的来源、剂量、时间、给与方式存在不同，但均减轻了肺损伤[35-40]。多数研究表现为MSCs降低了炎性反应、肺水肿、胶原沉积，改善了肺部组织学损伤，保护了内皮屏障功能；在分子水平，MSCs促进ARDS模型抗炎细胞因子生成；在细胞水平，MSCs增强了Treg细胞反应，增强了巨噬细胞吞噬活性，降低了中性粒细胞数量。尽管MSCs治疗肺损伤取得了重要进展，但仍需要进一步研究以阐明MSCs最佳来源和剂量、给药途径和频率等一些未解决的问题。并且在多数实验方案中，MSCs是在疾病诱导之前、同时或之后短时间内施用，这些模型没有考虑到肺部和远端器官损伤的时程，可能与临床情况存在差异性。

如何进一步优化MSCs疗效是研究的重点。目前研究主要集中在基因修饰、预处理等方面提高MSCs治疗ARDS潜力。基因修饰不仅增强了MSCs向损伤部位迁移、促进组织修复的内在能力，而且提高了其在恶劣微环境中的生存能力。目前报道的候选基因有CXCR4、EP2、HO-1、ACE2、HGF、sST2、IL-10、KGF等[41]。如病毒转染MSCs使其高表达sST2,降低了中性粒细胞数量，降低了肺泡灌洗液促炎因子IL-6、TNF-α浓度，增强了MSCs抗炎作用[42]；过表达KGF的MSCs改善了肺微血管通透性，降低了LPS引起的肺损伤[15]；过表达VEGF的MSCs抑制了内皮细胞凋亡，降低内皮屏障通透性，改善了肺水肿[18]。用TLR3配体poly(I:C)预处理MSCs，抑制了MSCs miR-143的表达并增加了COX2的表达，从而增加PGE2产生和巨噬细胞抗炎效果[43]。预处理MSCs方法包括低氧、ARDS患者来源的血浆、N-乙酰半胱氨酸、TGF-β1预处理及MSCs三维培养等，通过改善MSCs的微环境来增强MSCs的抗炎、抗氧化、免疫调节等疗效[41]。除了通过基因修饰和预处理外，也可通过选择5代以内MSCs及调整肺微环境来优化MSCs的治疗。

4 MSCs治疗ADRS的临床研究及疗效影响因素

目前报道有3项已完成的MSCs治疗ARDS的临床试验。一项单中心随机双盲的Ⅰ期临床试验报道了静脉注射同种异体脂肪来源的MSCs(1×106/kg)治疗ARDS的安全性(无致瘤性)[44]，但与对照组相比，在住院时间、呼吸机使用时间及ICU入住时间上没有明显差异。另一项多中心的Ⅰ期临床试验报道了不同剂量(1×106、5×106、10 ×106/kg)骨髓来源MSCs治疗ARDS的安全性[45]，在此基础上进行的Ⅱa期临床试验表明MSCs(10×106/kg)改善了ARDS患者的氧合指数[46]。一项病例报告报道了2例重症难治ARDS患者接受骨髓源性MSCs(2×106/kg)治疗后，呼吸窘迫、血流动力学紊乱、多器官衰竭等方面均有改善，可能与血液中炎性标志物的减少有关[47]。有研究报道月经血源性MSCs的移植可降低H7N9病毒诱发ARDS患者的病死率，5年随访期内没有不良反应发生[48]。中国临床试验注册中心注册了10项关于MSCs移植治疗COVID-19、ARDS患者有效性和安全性的研究。其中一项研究表明，移植人类脐带衍生的MSCs改善了1例65岁女性COVID-19患者病情[49]，另一项研究报道了7例COVID-19患者(1例危重症，4例重症，2例轻症)，接受MSCs静脉注射后肺功能和症状得到明显改善，在14 d观察期内没有出现严重的不良反应，炎性因子下降，外周血淋巴细胞回升[50]。MSCs治疗ARDS的疗效需要更多临床研究来评估。

MSCs来源、给药途径、最佳剂量等是影响MSCs疗效的重要因素。MSCs可来源于骨髓、脂肪、脐带、羊膜、胎儿血、月经血等，不同来源的 MSCs 在增殖速度、分泌细胞因子和免疫调节能力上存在差异，即使同种来源，不同个体之间的MSCs也出现功能上的异质性。脐带和羊膜来源的MSCs增殖能力上具有明显的优势，脂肪和骨髓次之；免疫调节能力方面，脐带、羊膜和脂肪来源的MSCs优于骨髓MSCs，而胎盘MSCs的免疫调节能力最差；分泌细胞因子谱方面，脐带MSCs分泌细胞生长因子的总量明显高于骨髓MSCs，但是不同来源的分泌细胞因子谱有明显的特点。静脉注射是MSCs移植最常用和简单的途径。由于肺部血管系统特性，静脉注射最大的弊端就是肺部能清除大量MSCs，造成趋化到损伤部位发挥治疗作用的MSCs数量减少。健康和疾病状态下，MSCs在体内的代谢动力学有差异，低氧环境可以增加MSCs在肺部滞留。MSCs治疗ARDS的最佳剂量，目前并没有形成统一的标准，这与MSCs不符合传统药物典型的分布和代谢模型有关。目前的临床研究中，静脉注射MSCs的剂量范围相对稳定，集中在1×106～10×106/kg。未经体外扩增的MSCs细胞本身安全无害，体外扩增最大风险在于基因突变，骨髓MSCs体外培养至30代时出现染色体异常，脐带MSCs体外培养至18代就出现了基因突变，同时随着体外增殖代数增加，MSCs增殖活性、分泌细胞因子能力都在降低。目前认为5代以内的MSCs增殖能力、旁分泌信号通路、分化潜能和DNA稳定性均维持在较好的状态[41]。