原核生物胞外囊泡的生成与功能

陈鸣，殷勇

(国家儿童医学中心 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心呼吸科，上海 200127)

细胞外囊泡是普遍存在于真核细胞及原核细胞中的一种脂质双分子密闭球形结构[1]。Chargaff和West[2]于1946年首次在血浆中发现细胞外囊泡，并认为其是血小板促凝血颗粒，Wolf[3]于1967年将其定义为“血小板粉尘”。但随着研究的深入，学者发现细胞外囊泡并不是简单的细胞碎片，它的功能丰富，且多种细胞均具有分泌细胞外囊泡的特点[4]。根据分泌细胞的不同以及刺激因素的差异，所产生的细胞外囊泡结构及功能也具有一定的异质性。细菌的细胞外囊泡首次在大肠埃希菌中被发现[5-6]。来自革兰阴性菌的细胞外囊泡通常被称为外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMV)，其已被证实可以携带多种物质，包括细菌毒力因子、黏附素、核酸、免疫调节因子等。细胞外囊泡在分子传输、应激反应的调节，以及生物膜形成方面起重要作用。它可以将较高浓度的多种效应分子运送到远处，通过膜融合和(或)内化将效应分子传递至靶细胞内；保护性地将对细菌生存不利的错误折叠蛋白、抗菌肽、补体等清除出细胞[7-8]；同时作为生物膜形成的重要成分，细胞外囊泡能保护细菌免受损害。而革兰阳性菌由于为厚壁结构且无细胞外膜，所以直到1990年，有关革兰阳性菌的细胞外膜才被报道[9]，随后陆续发现金黄色葡萄球菌、炭疽芽孢杆菌、李斯特菌、产气荚膜梭菌、肺炎链球菌、变形链球菌等阳性球菌均可以产生细胞外囊泡。起源于革兰阳性菌的柔膜类细菌也被证实具有分泌细胞外囊泡的作用，并具有与OMV相似的生物学作用[10]。目前，已有将革兰阴性微生物的囊泡开发成治疗性疫苗的研究[11]。因此，全面了解细胞外囊泡的产生机制，可能有助于设计靶向细胞外囊泡产生过程的药物和制造含有理想抗原的细胞外囊泡，以生产出更有效的疫苗。现就原核生物胞外囊泡的生成与功能予以综述。

1 细胞外囊泡的生成

1.1革兰阴性菌 革兰阴性菌具有两层包膜，称为外膜和内膜。外膜是一种不对称的双侧脂质结构，脂多糖是外叶中最丰富的脂质。脂多糖由脂质A、聚糖核心和称为O抗原的长多糖侧链构成[12]。外膜与内膜之间形成细菌的周质空间，周质是一种氧化环境，占总细胞体积的7%～40%[13]。周质内薄的、刚性的肽聚糖层，通过膜锚定蛋白质连接到内膜和外膜上。革兰阴性菌通过产生直径为20～250 nm的小球形结构——OMV，释放外膜和周质。其机制如下。

1.1.1周质空间压力的增加 生理情况下，细胞壁在更新过程中，会在转移至细胞质之前，以低分子量肽聚糖片段存在于周质中，而肽聚糖片段的积累可产生膨胀压力使得外膜弯曲形成OMV。Hayashi等[14]研究发现，自溶素活性降低的牙龈卟啉单胞菌细胞外囊泡分泌增加。作为细菌重要的胞壁质水解酶，自溶素可切割肽聚糖中的共价键，负责细胞壁重构、肽聚糖转换、细胞分裂和肽聚糖细胞壁修复。自溶素的活性降低，导致细胞壁不能完全降解，细胞壁中间体的积累使得周质空间压力增加，从而引起外膜膨出。另有研究证明，囊泡释放的数量与细胞包膜中错误折叠蛋白质积累的水平直接相关，错误折叠的蛋白质聚集在外膜的内表面，在膜上产生压力[15]。虽然以上研究从某些方面解释了囊泡产生的机制，但理论上细菌的外膜可以承受3个大气压的膨胀压力。因此，如果单纯用周质空间压力增加，引起外膜膨出，从而导致OMV分泌增加，很难令人信服。在对细胞外囊泡成分的研究中，更多的证据表明细胞外囊泡内物质的包裹是主动选择的结果[16-18]。因此，囊泡内肽聚糖片段或错误折叠蛋白的富集，也可能是细胞自身防御、抵抗的主动选择。

1.1.2外膜与肽聚糖交联减少 革兰阴性菌外膜与肽聚糖的交联，对于维持外膜的稳定十分重要。而肽聚糖相关脂蛋白、胞壁蛋白脂蛋白A和外膜蛋白A是革兰阴性菌外膜与肽聚糖之间的重要交联蛋白。当交联蛋白减少时，OMV的产生增加，反之亦然。在相同的刺激下，一些脂蛋白、肽聚糖层相关交联蛋白的基因突变株均表现细胞外囊泡较野生株分泌增多的现象[19-20]。这表明，细胞外囊泡更倾向于在外膜与肽聚糖交联减少处分泌，同时也解释了具有更低脂蛋白水平的铜绿假单胞菌较大肠埃希菌外膜可以产生更多OMV的现象[21]。然而，由于一些突变株在检测细胞外囊泡的同时显示出细胞内组分的大量渗漏，因此不能排除一些囊泡的增加可能是由细胞裂解引起。如果仅是减少外膜与肽聚糖的交联，不能使外膜膨出囊泡化，所以可能在交联减少、囊泡化概率增加的情况下，同时联合了周质空间增加的膨出压，从而共同导致外膜的囊泡化。

1.1.3膜曲率诱导分子的富集 作为周质空间压力增加的替代或补充，曲率诱导分子可引起膜膨胀。脂多糖是革兰阴性菌外膜外表面的主要脂质，其由脂质A、核心寡糖和O-多糖侧链组成；核心寡糖和O-多糖侧链与脂质A连接从细菌向外延伸。虽然当pH值为7时脂多糖基团呈电离状态，但它们可以与Mg2+和Ca2+结合形成盐桥，使相邻的脂多糖分子盐结合在一起，从而维持外膜的稳定[22]。铜绿假单胞菌能够合成两种类型的脂多糖，分别为A带脂多糖和B带脂多糖，两者的区别在于O-多糖侧链组成不同：A带脂多糖的侧链不带电，B带脂多糖侧链带明显的负电荷。其中，铜绿假单胞菌OMV主要含有B带脂多糖，而外膜包含A带脂多糖和B带脂多糖，B带脂多糖为次要外膜成分。外膜如果具有过多带负电荷的B带脂多糖，会造成阴离子间的排斥反应，影响外膜稳定，从而导致外膜曲率增加。而细菌通过分泌主要含有B带脂多糖的细胞外囊泡，可能是其维持膜稳定的一种方式。有关铜绿假单胞菌喹诺酮信号(pseudomonas quinolone signal,PQS)刺激囊泡产生的研究证明了这一观点。研究发现，PQS插入外膜外叶中可刺激细胞外囊泡的形成及自身的包装和运输，其机制为PQS可以与二价阳离子结合，增加脂多糖间的阴离子排斥，引起细胞外膜膨出[23-24]。而诱导细胞外囊泡形成的庆大霉素也具有相似的机制[25]。脂质A中的酰基链数量影响了分子倾斜至膜的角度，故减少脂质A中的酰基数量会减小分子的疏水截面积，将其从圆锥形变为圆柱形或倒置的圆锥形，从而改变细菌外膜曲率。Elhenawy等[26]研究发现，脱酰基脂质A的增加，可以引起细菌分泌细胞外囊泡的数量增加，且在分泌的OMV中检测到了脱酰基脂质A的富集。而Roier等[16]的研究发现VacJ/Yrb ATP结合盒(ATP-binding cassette,ABC)系统可能参与OMV的产生。这种ABC转运系统参与了将外膜磷脂转运至内膜，防止磷脂在外膜的外部小叶中积聚。而VacJ/Yrb ABC转运系统的破坏，使得磷脂在外部小叶中积聚，从而改变了外膜曲率，增加了的OMV产生。

1.2革兰阳性菌 革兰阳性菌是一类由质膜和厚的肽聚糖层包裹的细菌，由于其缺乏外膜且细胞壁较厚，起初人们认为它们不能产生和分泌细胞外囊泡。直至2009年Lee等[27]首次分离出金黄色葡萄球菌细胞外囊泡，并对革兰阳性菌细胞外囊泡的成分进行广泛的蛋白组学研究，证实了革兰阳性菌同样具有分泌细胞外囊泡的功能。迄今为止，人们已在金黄色葡萄球菌[27]、芽孢杆菌[28]、产气荚膜梭菌[29]、李斯特菌[30]和肺炎链球菌[31]等革兰阳性菌中发现了细胞外囊泡的存在。

对于细菌胞外囊泡如何突破厚的细胞壁，一直是人们讨论的热点。在对金黄色葡萄球菌细胞外囊泡成分的分析中，学者发现细胞外囊泡携带肽聚糖降解酶，其可以降解厚的革兰阳性菌肽聚糖细胞壁[27]。另一项关于枯草芽孢杆菌的研究发现，原噬菌体表达的内溶素导致肽聚糖层的破坏，从而引起细胞外囊泡的形成[32]。对于近年发现的细胞外囊泡特殊类型——管状膜状结构(又称之为纳米管、纳米线)，有学者提出可能是革兰阳性细胞壁的局部裂解导致细胞质膜膨胀，而细胞质膜又引发纳米管形成[33]。虽然目前缺乏革兰阳性菌如何突破厚层细胞壁的确切证据，但可从一些对细胞外囊泡成分、形态等的研究中探索一些可能的机制。

1.3柔膜体纲类细菌 柔膜体纲类细菌是起源于革兰阳性菌门的一种特殊细菌，经过进化它们成为一类无细胞壁的微小原核生物，系统发育上接近梭菌属[34]。Chernov等[35]于2011年首次在莱氏无胆甾支原体PG8中证实了柔膜体纲类细菌细胞外囊泡的分泌，并在电镜下发现了其类似革兰阴性菌出芽式的发生机制。而Gaurivaud等[10]更是在3种科属的柔膜体纲类的5种细菌中证实了细胞外囊泡的分泌，分泌的细胞外囊泡大小变化很大，直径为30～220 nm，且通过蛋白组学分析发现，其富含毒力蛋白。故推断，细胞外囊泡的存在可能在柔膜体纲类细菌感染后，机体发病的过程中起关键作用。

2 细胞外囊泡的作用

作为细菌来源的不溶性及可溶性物质的混合物载体，细胞外囊泡在细菌与细菌及细菌与宿主之间的通讯和相互作用中发挥重要作用，其使得细菌能在不利条件下更好的生存，并刺激宿主的免疫炎症反应。同时细胞外囊泡天然的免疫原性，或经过人工设计提高的免疫原性，已被运用于一些感染性疾病的疫苗研制。

2.1分泌传递物质 当细菌处于不利条件(营养缺乏)时，细胞外囊泡的分泌水平升高；而对细胞外囊泡进行分析发现，其包含一些降解酶和受体，可以帮助细菌获取营养，促使细菌存活[36]。如铜绿假单胞菌分泌的含有PQS的细胞外囊泡，PQS在细胞间通讯和群体感应中发挥重要作用[37]；同时PQS有与铁载体相似的作用，铁对于细菌生存十分重要，含有PQS的细胞外囊泡可以在铁缺乏的情况下，帮助细菌分泌至远处与铁结合，并通过细胞外囊泡膜融合、内化等方式，将铁提供给细胞[38]。此外研究发现，在广泛运用抗生素的过程中，细菌通过进化突变，产生了一定的抗生素抗性[39]，且可能通过细胞外囊泡分泌的方式将具有抗生素抗性的相关蛋白或基因进行细菌间的转移。如将抗生素抗性蛋白(β-内酰胺酶)转移到邻近细胞[40-41]或通过OMV与受体细胞膜融合后，将抗性基因转移至受体细胞[42]。虽然细胞外囊泡的分泌对于细菌自身是一个耗能的过程，但这种分泌方式有着不可取代的优点：①细胞外囊泡的包裹结构，避免了生物微环境中细胞外蛋白酶对蛋白的降解；②细胞外囊泡内物质富集、体积小的特点，使得它们可以远离亲本细胞高浓度地将某些物质传递给靶细胞。

2.2维持内环境稳态 细胞外囊泡的分泌，是细菌面对不利条件维持自身内环境稳态的重要方式之一。在使用外部刺激物(乙醇和多黏菌素)和内部刺激物(过量表达毒性周质蛋白)处理大肠埃希菌时，大肠埃希菌的超囊泡突变菌株能更好地在包膜应激条件下存活，且囊泡中错误折叠蛋白的水平较管家蛋白明显升高[43]。此外，细胞外囊泡还可作为诱饵来保护细菌免受补体成分[7]、长链醇、金属螯合剂[44]和抗菌肽[8]的影响，可见细菌可通过分泌细胞外囊泡的形式清除有害物质。

2.3协同构成生物膜 生物膜的形成是细菌生存的重要策略，它可以提高细菌对抗生素的耐受性，避免不良物质的渗入，抵御高温、干燥等[45]。细菌在生物膜中以多细胞群体的形式存在，作为生物膜细胞外基质的一部分，细胞外囊泡发挥重要作用[46]。细胞外囊泡存在的多价黏附素，使得细菌之间能够黏附与共聚集。牙龈卟啉单胞菌分泌的含有黏附素的细胞外囊泡，有助于牙菌斑生物膜的发育[47]。除黏附作用外，细胞外囊泡还可以介导生物膜内外的相互作用，可通过群体信号转导分子介导细胞间通讯[37]，并向生物膜中的细菌进行营养输送，结合或灭活抗生素、补体、抗体等有害物质[7,48]。同时，细胞外囊泡的存在可以作为生物膜的攻击性工具，裂解竞争细菌[36]。

2.4与宿主相互作用 人体细菌主要由厌氧菌组成，在健康的个体中，它们以与宿主共生的形式存在。这些厌氧菌具有重要的生理作用，如抑制病原微生物的生长、调节上皮屏障的分化、帮助营养物质的代谢以及先天免疫功能的刺激等。虽然有上皮组织作为第一道屏障，但共生细菌产生的细胞外囊泡可“穿过”这种上皮屏障并与一些结缔组织细胞(主要为免疫细胞)相互作用。人类微生物群中的一个成员脆弱拟杆菌显示分泌含有荚膜多糖的OMV，其可以触发树突状细胞中Toll样受体2介导的信号转导，诱导白细胞介素-10的产生，调节T细胞的分化，提示细胞外囊泡是建立共生的重要媒介[49]。

此外，致病菌分泌的细胞外囊泡在致病过程也有重要作用：①保护细菌免受宿主免疫反应的攻击，在营养稀缺的情况下获取营养。②细胞外囊泡还携带着重要的细菌毒力因子，如产毒性大肠埃希菌胞外囊泡中的肠毒素及放线杆菌胞外囊泡中的白细胞毒素等，细胞外囊泡可以将这些毒素高效地运输至远离亲本细胞的远处，通过不同的机制将毒素传递到宿主细胞内，造成更多、更大的损害[50-51]。然而，细胞外囊泡与宿主之间的作用复杂多样，需更多的研究进一步探讨。

2.5疫苗的研制 细胞外囊泡含有一些天然免疫刺激配体，如脂多糖、肽聚糖和细菌DNA等，称之为微生物相关分子模式，它们可以被病原识别受体识别结合，从而引起促炎因子、趋化因子的产生和免疫细胞的募集[52]。一项有关脑膜炎奈瑟球菌细胞外囊泡的体内研究，在小鼠体内检测到了长达120 d的记忆B和T细胞，且分泌的多种抗体具有杀菌活性，可见细胞外囊泡可诱导持久的体液免疫[53]。同时，霍乱弧菌细胞外囊泡也被证实可在小鼠体内诱导产生持久的血清IgG、IgA、IgM及分泌型IgA，且还可在脾中引发更高百分比的CD4+T细胞分布[54]。有证据表明，具有较厚细胞壁的革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌[55]、肺炎链球菌[31])中分离的细胞外囊泡可以引发免疫反应，在某些情况下提供疾病的保护。细胞外囊泡的免疫原性使其用于疫苗的研制成为可能，且因为它有类似细胞膜的结构，所以相较于纯化的抗原，细胞外囊泡更能以天然构象显示抗原，在产生中和抗体方面也更为有效。此外，细胞外囊泡的稳定结构、对内容物的保护以及可相对低成本大量获取等特性，也使其在疫苗的研制中具有一定优势。目前包含OMV的多元B群脑膜炎球菌疫苗已在26个医学中心进行了Ⅲb期临床试验，用于预防侵袭性脑膜炎球菌病，且安全性及有效性得到广泛认可[56]。

3小 结

根据目前的研究结果，原核生物普遍具有分泌细胞外囊泡的功能，但对于其产生的具体机制尚不完全明确。其中，周质空间中肽聚糖片段或错误折叠蛋白质的积累在外膜上施加压力；肽聚糖层之间交联的减少；膜曲率诱导分子的富集是目前普遍认可的3种机制，但这些机制的提出可能局限于特定菌种或特定条件，不具有完全的普遍性。近年有研究提出，高度保守的VacJ/Yrb ABC转运系统的破坏可能是参与OMV生成的一般机制[22]。细胞外囊泡具有重要的生物功能及利用价值，运用细胞外囊泡研制的疫苗已被许可用于脑膜炎奈瑟球菌病的预防[57]，更多革兰阴性菌OMV制剂也在研究中。可见，细胞外囊泡在治疗方面具有广阔的应用前景，但同时在细胞外囊泡的生产过程中也存在批次的一致性和纯度、组织特异性等问题。因此，未来深入研究细胞外囊泡的产生机制及其相关特性，可为疾病的治疗及预防提供新思路。