脑白质缺血性损伤与再生的体外模型研究进展

邱 杨 张 菁

少突胶质细胞是大脑白质中最为重要的胶质细胞，它们包绕神经元轴突形成髓鞘，为轴突的生长提供营养支持，同时由于髓鞘的绝缘作用使得神经元电信号的传播更为迅速[1]。少突胶质细胞对于诸如脑缺血导致的兴奋性氨基酸以及氧化应激十分敏感，急性脑缺血或长期低灌注状态都会导致严重的白质损伤[2]。作为补偿效应，损伤周围或者新生细胞聚集的脑室下区(subventricular zone，SVZ)中的OPCs可以增殖、迁移到损伤部位，重新分化成熟，最后形成新的髓鞘[3, 4]。然而，构建脑白质缺血性损伤与再生的动物模型难度较大，模型的影响因素也较为复杂，且构建如慢性低灌注损伤模型费时久。而作为条件更为可控的体外模型，建模难度小、费时短，因此能较快筛选出有前景的药物。本文旨在对少突胶质细胞缺血性损伤与再生的体外模型的建立方法以及优缺点进行综述，以期对后续实验有所帮助。

一、OPCs体外缺血模型

1.少突胶质细胞体外活力或功能试验:脑缺血或者长期低灌注损伤会造成过谷氨酸过度释放导致的兴奋性毒性、组织血氧下降以及营养因子下降。为了模拟这些损伤，体外模型中有谷氨酸兴奋性毒性损伤(培养液中添加谷氨酸 24h)、饥饿(去除原培养液中OPCs生长必须的营养因子)、糖氧剥夺实验(将细胞置于低氧培养箱且细胞液换位无糖培养基 4h，4h后恢复正常培养称为复灌)以及在培养基中添加7天亚致死量的CoCl2来诱导长时间化学缺氧的这几种模型[5～8]。首先，制备纯化的OPCs方法如下[9]：从出生后的第2天的SD大鼠断头取脑，冰上分离大脑皮质，胰酶消化脑组织后，得到的混合胶质细胞在Neurobasal培养液中培养过夜，补充有血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor AA, PDGF-AA)和碱性成纤维细胞(basic fibroblast growth factor，bFGF)生长因子3天。当细胞铺满瓶底时，两次梯度离心去除小胶质细胞以及星形胶质细胞后得到纯化的OPCs。这些纯化培养的细胞可以通过神经元胶质细胞抗原2(neuron-glia antigen 2, NG2)的免疫荧光染色鉴定，超过95%的培养细胞是OPCs。然后将纯化培养后的OPCs放入以上描述的各体外损伤模型中。损伤的同时还可以添加药物共同孵育，通过对少突胶质细胞形态的观察(凋亡的少突胶质细胞细胞与细胞间界限不清晰，成团块状生长)以及MTT试验细胞活力检测或者TUNEL凋亡测试就能对该药物是否有神经保护作用进行评估。

2.少突胶质细胞增殖试验：如果要对药物对少突胶质细胞增殖情况进行评估，可以通过细胞计数，或者通过ki-67或者Brdu染色对增殖细胞进行免疫荧光标记进行计算[10]。结合以上OPCs体外缺血模型能够用来评估哪些因子能直接妨碍OPCs存活或者抑制其增殖，因此可以基于这些因子进而筛选出模拟缺血缺氧条件下对少突胶质细胞保护作用的药物。另外，还可以进一步阐明缺血缺氧条件下OPCs死亡的分子机制。

二、OPCs迁移试验

1.Transwell试验:Transwell是一种上室可分离的双层培养板，中间以聚碳酸酯膜相隔。方法如下：试验时将OPCs以5×104个细胞(分布在50μl DMEM以及0.5% FBS培养液中)的密度种植在上边小室中，下面小室中添加同样培养液[11]。Transwell试验有两种模式，分别可以考察药物或者因子对细胞的趋化性/趋药性以及趋动性。仅在下室添加药物考察趋药性(上下室药物浓度不同)，而趋动性为上下室都添加相同浓度的药物。趋药性表明对细胞的直接吸引力/排斥力，而趋动性表明药物对细胞的随机运动水平的作用。最后对穿过聚碳酸酯膜进入到下室的细胞的数量进行固定，染色然后拍照统计，就可以判定该药物对OPCs迁移作用。作为最常见的体外迁移试验，这种方法有诸多优点。首先，试验周期短，试验结果明显。其次，由于Transwell小室中需要加的液体量相对较小，因此同其他迁移试验相比生长因子或者拮抗剂等药物需要添加的量少。另外，虽然最终结果是以清点迁移后的细胞数呈现，属于劳动密集型的方法，但却相对客观、准确。但这个方法也有一个缺点，即需要大量的细胞，而且Transwell小室的只能一次使用，不能循环利用，且价格不便宜。

2.琼脂糖迁移试验:琼脂糖迁移试验是将分离后的的OPCs以5×107个细胞/毫升的密度重悬于SATO培养液中(添加10%FBS以及0.3%低熔点琼脂糖)，继续放在37℃的培养箱中培养(防止此时琼脂糖硬化)[12]。取1.5μl上述重悬液于24孔板中央，紧接着将培养板放在4℃冰箱中15min用于硬化琼脂糖。冷却后，在琼脂糖液滴周围添加50μl SATO培养液，2h后继续沿着孔壁添加450μl SATO培养液，此时或24h后可在SATO培养液中添加待测试的药物或因子。之后的1～6天，每天记录迁移出琼脂糖液滴的OPCs离液滴最远的距离。距离越远表示迁移能力越强。因为该迁移试验持续时间长，必须在SATO培养液中添加抑制OPCs增殖的阿非迪霉素(aphidicolin)用于排除OPCs增殖可能对其迁移结果的影响。

首先，这个试验能在更多的时间点来评价细胞迁移的程度。其次，在试验开始以后能够通过添加或者撤销拮抗剂，实现逆转。但是缺点在于试验周期较长，并且试验过程中，少突胶质细胞能合成、分泌其他能影响迁移的因子，干扰试验。

3.划痕试验:划痕试验是在铺满单层细胞的培养皿中人为地创造一条缺口，即“伤痕”[13]。接着缺口两边的细胞会移动，慢慢“愈合”这一“伤痕”。首先需要在培养皿中种上约能覆盖培养皿70%～80%面积的细胞，用细胞刮刀在培养皿中间划开一条细胞缺口。接着通过换液，悬浮的细胞会被清洗掉。然后用添加了待测药物或因子的SATO培养液进行培养(不添加生长因子)。最后，24h或48h后，对越过缺口的OPCs数量进行统计。

划痕试验是分析细胞迁移试验中最简单，也是花费最少的方法。整个试验所需的材料并无特殊，且实验条件不苛刻，易改良。其次，还能观察到少突胶质细胞迁移中的形态。但是不像Transwell试验，划痕试验中不能制造化学梯度，因此不能检测对某种因子或药物的趋化性。而且划痕试验比较费时，首先需要10～15天来种植细胞到培养皿以及划痕，之后还需要1～2天来观察划痕后的迁移结果。最后一个缺点是由于试验在培养皿中进行，因此需要大量的细胞以及试验药物。

三、少突胶质细胞分化模型

1.少突胶质细胞分化培养:少突胶质细胞分化培养是在OPCs培养的基础上进行的实验[14]。纯化后的OPCs以2.5×104个细胞/平方厘米接种在培养板上(此时培养液为SATO，添加1%青霉素/链霉素，1%胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基添加剂以及0.5% FBS, 10ng/ml PDGF-AA 以及10ng/ml FGF-2)。添加PDGF-AA和FGF-2是为了促进OPCs的黏附、生存以及增殖。以OPCs培养液培养1天后，将原培养液中的PDGF-AA以及FGF-2换成3%FBS后随即进入分化培养实验。培养7天后，培养的细胞就是以成熟少突胶质细胞为主的细胞，即80%以上细胞表达髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)，少部分细胞表达NG2。

2.少突胶质细胞分化形态分析:这是评价增殖阶段或者分化阶段添加的药物或因子能否对少突胶质细胞分化过程起抑制作用的重要步骤。可以通过分别计算OPCs细胞数(NG2阳性)以及成熟少突胶质细胞数(MBP阳性)的变化来说明药物对OPCs分化的作用，如果抑制分化，应表现为OPCs细胞数增多，成熟少突胶质细胞减少或不变[15]。另外，由于少突胶质细胞分化过程中，形态会逐渐变化。因此在MBP阳性细胞中，针对其形态不同分为简单分枝的少突胶质细胞，复杂分枝的少突胶质细胞以及部分形成膜结构的少突胶质细胞。而对此进行的分类统计可以从形态上直接说明OPCs分化过程是否受到影响。也可以通过Image J软件进行单个MBP阳性细胞的细胞直径以及分枝复杂程度的评判，最终结果以单位直径的分枝数计算，但是最少需要统计50个细胞。

四、少突胶质细胞-神经元共培养体系

脊髓背角神经元(dorsal root ganglion, DRG)与少突胶质细胞共培养[16]。首先需要培养DRG神经元：DRG神经元由孕期15天大鼠中获取，并在37℃下用木瓜蛋白酶，1-半胱氨酸和DNA酶解离60min。解离后，加入含有10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的DMEM培养基以终止酶作用，离心5min收集细胞。最后，将150μl密度为1.5×105个细胞的细胞悬液涂布在涂有多聚赖氨酸和生长因子减少的基质胶的盖玻片上，并在补充有10%FBS的DMEM(含1%青霉素/链霉素和100ng/ml神经生长因子)中培养21天。为了去除污染细胞，在接种后在1、4和7天用5-氟-2′-脱氧尿苷将培养物脉冲3次，持续48h。培养基每2天更换1次，21天后培养基更换为基础培养基。然后，按上述方法分离培养OPCs。最后，将纯化的OPCs以每个盖玻片7.5×104的密度接种到神经元上。共培养物保持15天，培养基每2～3天更换一次。髓鞘形成开始于共培养后的第6天，并且可以观察到在第9天附近形成第一髓鞘。在14天大多数OPCs已经分化为成熟少突胶质细胞并且发生了广泛的髓鞘形成。神经突密度与形成髓鞘的少突胶质细胞百分比之间的关系为髓鞘分析提供了坚实的基础。共培养体系的优点是能保持少突胶质细胞-神经元相互作用的生理相关性并维持体外细胞培养模型的便利性，且这种培养体系可以研究髓鞘形成而没有其他类型神经细胞的混淆效应。

五、小脑切片培养

尽管体外细胞培养是非常有用且易于获得的模型，但它们的主要缺点在于生长在培养皿或培养板上，而在于丧失了三维结构。因此，利用上述体外模型，不可能维持正常结构以及脑组织中存在的所有细胞-细胞和细胞-基质相互作用。为了克服这个问题，有人使用离体脑切片培养研究不同的神经生物学过程，这样可以保留支持所有组织回路和相互作用的三维建筑组织。切250～400μm的厚脑片，置于半乳胶膜上生长，并保持气-液界面，这导致更少更薄的组织并且维护和处理更为简单。当主要目标是评估髓鞘形成的变化时，通常使用器官型小脑切片培养物，可以在视觉限定的区域中评估少突胶质细胞成熟过程和髓鞘形成过程。事实上，小脑中的髓鞘形成发生在出生后，来自早期出生后动物的小脑切片培养物复制了体内髓鞘形成过程[11]。此外，小脑是特定区域哺乳动物大脑中最大的纤维束，即白质束，这使得它成为评估髓鞘形成有利和实用的模型。

六、展 望

用于评估少突胶质细胞缺血性损伤、再生的体外模型尽管由于缺乏脑回路以及缺乏系统循环和完整的体内信号转导而受到限制，但仍然是用于评估化合物/药物的细胞毒性或治疗功效的相对简单且有用的工具。因为体外模型能直接鉴定不同损伤或疾病的靶点的同时，在相同培养条件下对针对该新靶点药物的效果进行直接测定，因而能节约体内实验中使用的动物数量，缩短研究周期。另外，体外模型更能聚焦少突胶质细胞损伤或再生的不同阶段进行研究，排除整体动物实验因无法剥离损伤与再生的各个阶段的干扰。而在与神经元细胞的共培养系统或者小脑切片模型中，一定程度上可以囊括其他细胞对少突胶质细胞的影响，因而能在某种程度上降低非整体研究的局限性。