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caspase-3和caspase-8在铅中毒大鼠心肌细胞中的表达特点研究

2020-10-28赵红宇李亚山朱为梅李德旋杨红玲

医学研究杂志 2020年3期
关键词:铅中毒醋酸低剂量

赵红宇 李亚山 朱为梅 吴 菲 李德旋 周 盛 杨红玲

慢性铅中毒是由于铅的累计吸收(人体每日铅吸收量超过0.5mg可发生蓄积作用,当血铅含量超过50μg/dl可判断为慢性铅中毒)而导致的非传染性疾病[1]。有研究显示随着我国工业化发展和日常含铅产品增多,慢性铅中毒发生率逐年升高,且呈个别地区集中性[2]。铅在摄入后主要与血浆蛋白结合,而血浆蛋白可借助于血液流动分布全身,数周后约有95%以磷酸铅成分沉积于骨骼和毛发。其余5%则分布于软组织如肝脏、脾脏、肾脏、脑等。近年来铅中毒受到众多学者的关注,包括肝、肾以及神经系统均有文献报道[3,4]。2016年本研究组在云南某地进行铅中毒流行病学调查发现,铅中毒地区心力衰竭发生率是正常人群的2.3倍,因此笔者推测铅中毒可能对心肌有一定损害。目前关于铅中毒损伤心肌的报道主要见于急性铅中毒,慢性较少,因此本研究探讨慢性铅中毒对心肌的影响,以进一步明确铅中毒对心肌的损害作用,为今后临床中治疗慢性铅中毒提供参考。

材料与方法

1.实验材料:(1)实验动物:清洁级雄性SD(Sprague Dawley)大鼠40只,体质量160~180g,购于昆明医科大学动物实验部,实验动物合格证号2011-004。所有大鼠在购买后均饲养于云南中医药大学动物实验楼,饲养间为无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级,日常温度22~26℃,湿度40%~60%,光照和黑暗=12h/12h。(2)实验试剂:醋酸铅购于吴江市奥邦精细化工有限公司;白介素-6(interleukin-6,IL-6)、白介素-8(interleukin-8,IL-8)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)试剂盒购于上海岚派生物科技有限公司;血铅和心铅试剂盒购于成都安普诺生物科技有限公司;肌酸激酶(creatine kinase,CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes,CK-MB)以及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒购于南京森贝伽生物科技有限公司;多克隆兔抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,caspase-3)抗体、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(cysteinyl aspartate specific proteinase-8,caspase-8)抗体和单克隆兔抗β-肌动蛋白(β-actin)抗体购于美国Santa Cruz公司;二抗购于上海华壹生物科技有限公司;TRizol RNA、Taq polymerase以及DNA marker提取试剂盒购于宁波有成生物医药科技有限公司;RNA 反转录酶购于美国Promega公司;PCR引物购于上海生物生工公司。

2.实验方法:(1) 动物分组:适应性喂养期结束后,所有大鼠均采用尾静脉取血法收集血液,检测心功能指标CK、CK-MB和LDH(经检验所有指标均在正常范围内)。后采用数字表法随机分为正常对照组、低剂量铅中毒组、中剂量铅中毒组和高剂量铅中毒组,每组10只。(2) 造模方法:正常组大鼠给予0g/L醋酸铅水溶液,低剂量铅中毒组给予0.5g/L醋酸铅水溶液,中剂量铅中毒组给予1g/L醋酸铅水溶液,高剂量铅中毒组给予2g/L醋酸铅水溶液,连续给予1个月(给药剂量根据文献[5]报道确定)。(3) 血液和组织收集方法:1个月后隔夜禁食不禁水12h处死大鼠。处死大鼠采用3ml 1%水合氯醛腹腔注射麻醉,麻醉后固定于解剖板,腹主动脉取血法收集血液,后统一离心并收集上清分装于1.5ml的离心管中保存备用,血液收集后取出心脏,切取约1/4置于4%多聚甲醛溶液中保存用于病理学检测,其余保存于超低温冰箱备用。(4) 生化指标的检测:血铅、心铅、心功能指标CK、CK-MB和LDH、炎性因子指标IL-6、IL-8和TNF-α的测定均根据试剂盒提供的说明书进行。(5) 心肌组织苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)染色:HE染色操作参考文献[6]进行,具体为从多聚甲醛溶液中取出心脏组织,自来水冲洗24h后,常规石蜡包埋和染色,切片机切片后二甲苯脱蜡、梯度乙醇和超纯水依次清洗、HE染色、二甲苯透明封片即完成。(6)蛋白表达:待检测蛋白caspase-3以及caspase-8采用蛋白印迹法(Western blot法),称取心肌组织1g用组织蛋白裂解液裂解后提取上清,定量调平,然后每组各取50μg行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)凝胶电泳,电泳完成后半干转移法转移到聚偏氟乙稀(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,洗涤3次后5%脱脂牛奶封闭2h,取出后加入1抗封闭过夜,次日取出加入2抗孵育1h,洗涤3次后暗室曝光洗片,扫描仪扫描后计算各条带灰度值,每组实验重复3次。(7) 实时荧光定量PCR:待检测caspase-3和caspase-8的mRNA检测方法采用RT-qPCR法,从超低温冰箱中取出心脏组织,称取20mg用总RNA提取试剂盒提取总RNA,定量、反转录完成后,每组各取2μg行扩增反应。扩增条件为:95℃预变性2min,95℃变性10s、58℃退火30s、72℃延伸35s、循环次数40次,最后72℃延伸5min,完成后采用2-ΔΔCT法统计分析,引物设计见表1。

表1 引物序列设计表

结 果

1.大鼠一般情况:4组大鼠均无死亡,此外各组大鼠在饮食量上也没有差异,但铅中毒3个剂量组相较于模型组精神活动量有一定降低。

2.血铅和心铅含量比较:与正常组比较,低剂量、中剂量和高剂量铅中毒组血铅和心铅均明显升高(P<0.05)。与低剂量铅中毒组比较,中剂量和高剂量铅中毒组血铅和心铅也明显升高(P<0.05)。此外高剂量铅中毒组血铅和心铅也明显高于中剂量铅中毒组(P<0.05),详见表2。

表2 各组大鼠血铅和心铅含量比较

3.心功能指标比较:各组大鼠心功能血清学指标CK、CK-MB和LDH与正常组比较,低剂量铅中毒组和中剂量铅中毒组差异无统计学意义,高剂量铅中毒组则明显升高(P<0.05)。此外高剂量铅中毒组也明显高于低剂量铅中毒组和中剂量铅中毒组(P<0.05),详见表3。

表3 各组大鼠心功能比较

4.炎性因子指标比较:各组大鼠血清炎性因子指标TNF-α、IL-6和IL-8与正常组比较,低剂量、中剂量和高剂量铅中毒组明显升高(P<0.05)。此外高剂量铅中毒组TNF-α、IL-6和IL-8明显高于低剂量铅中毒组和中剂量铅中毒组(P<0.05),详见表4。

表4 各组大鼠炎性因子比较

5.HE染色:正常组大鼠心肌纤维排列整齐、表面光滑,低剂量铅中毒组和中剂量铅中毒组有一定心肌纤维排列紊乱,但和正常组差异并不明显,而高剂量铅中毒组则出现明显心肌肥大、纤维排列无序和细胞界限不清晰,详见图1。

6.实时定量RT-PCR结果:与正常组比较,低剂量铅中毒组和中剂量铅中毒组心肌组织caspase-3与caspase-8 mRNA表达没有差异,而高剂量铅中毒组则明显升高(P<0.05)。此外高剂量铅中毒组也明显高于低剂量铅中毒组和中剂量铅中毒组(P<0.05),详见图2。

7.蛋白表达结果:与正常组比较,低剂量铅中毒组和中剂量铅中毒组心肌组织中caspase-3与caspase-8蛋白差异无统计学意义,而高剂量铅中毒组则明显升高(P<0.05)。此外高剂量铅中毒组也明显高于低剂量铅中毒组和中剂量铅中毒组(P<0.05),详见图3。

图1 大鼠心肌组织HE染色(×400)A.正常组;B.低剂量铅中毒组;C.中剂量铅中毒组;D.高剂量铅中毒组

图2 各组大鼠心肌组织中caspase-3和caspase-8的mRNA扩增特点A.正常组;B.低剂量铅中毒组;C.中剂量铅中毒组;D.高剂量铅中毒组;正常组比较,*P<0.05;与低剂量铅中毒组比较,#P<0.05;与中剂量铅中毒组比较,ΔP<0.05

图3 各组大鼠心肌组织中caspase-3和caspase-8的相对表达A.正常组;B.低剂量铅中毒组;C.中剂量铅中毒组;D.高剂量铅中毒组;与正常组比较,*P<0.05;与低剂量铅中毒组比较,#P<0.05;与中剂量铅中毒组比较,ΔP<0.05

讨 论

铅中毒引起心肌损伤已得到大量临床和基础实验证实[7~10]。Chyeny等[11]研究发现,铅中毒人群相较于正常人群暂时性以及永久性心功能损害率均明显升高。刘颖等[12]以昆明市东川区某中型铜冶炼生产企业448例铅作业工人为考察对象,比较了心功能多项指标的变化特点,结果发现铅工作人员有明显心电图异常,心肌酶谱关键酶类CK-MB明显升高,且升高趋势与血铅浓度明显相关,工作人员接受驱铅治疗后,CK-MB则明显下降。此外还有很多类似的研究[13~15]。毫无疑问,上述研究均证实,铅中毒对心肌确有一定损害作用,这与本研究结论也是一致的。本研究采用不同剂量的醋酸铅构建慢性铅中毒大鼠模型,结果发现,与正常组比较,大鼠日常自由饮用2g/L醋酸铅水溶液1个月,可有明显心肌代谢酶异常,主要表现为CK、CK-MB和LDH的升高。同时在研究中检测了炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8的含量,研究结果发现,与正常组比较,低剂量、中剂量和高剂量铅中毒组TNF-α、IL-6和IL-8均明显升高,其与心功能的改变并不一致,分析原因可能是铅中毒早期就可能存在炎性反应的发生,只有达到一定阈值,才会引起心肌酶代谢谱的异常。

关于铅中毒引起心肌损害的主要原因:①脑皮质-心脏系统,部分研究者认为铅中毒对心功能的损害是通过脑皮质-心脏系统作用的,铅中毒后脑是首要损害器官之一,当脑中有大量铅沉积时,可引起大脑皮质兴奋与抑制功能紊乱,进而使神经转导异常,最终导致皮质-心脏调节障碍;②直接损害心肌,铅可直接作用心肌细胞,通过抑制心肌收缩和传导,进而诱发心肌细胞对外界刺激兴奋性异常,同时造成心脏自主神经紊乱,最终导致冠状动脉灌注不足;③损害阳离子转运酶系统,血铅可影响心肌微粒体中的阳离子转运酶,而阳离子转运酶与钙离子转运密切相关,钙离子转运异常最直接后果为心肌细胞功能紊乱[16~18]。但是总结上述成果,相关研究并没有涉及对心肌本身损害的研究。

细胞凋亡是细胞自主死亡现象,也是所有细胞的最终结局[19]。一般而言,细胞凋亡是正常的,但在病理情况下,如受到外界有害因子的刺激,其凋亡会加速发生[20]。由于心肌细胞具有不可再生性,因此当凋亡发生后,可能会带来心肌部分功能的永久丧失[21]。在凋亡调控相关蛋白中,caspase家族是核心之一,研究发现,caspase家族蛋白参与心肌细胞凋亡主要为caspase-8和caspase-3蛋白,其中caspase-8位于凋亡级联通路的上游,本身并不会促进凋亡,但可刺激下游caspase-3、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2相关x蛋白(Bcl-2 associated x protein, Bax)发挥作用,最终引起凋亡发生[22~24]。本研究结果显示,与正常组比较,低剂量和中剂量铅中毒组心肌组织中caspase-8和caspase-3并没有明显升高,而高剂量组则明显升高,分析原因,可能是大鼠对铅有一定的代谢能力,当在可控浓度范围内是不会对心肌造成损害的,而当其超出心肌可承受范围,则会造成心肌细胞凋亡。

综上所述,给予大鼠2g/L醋酸铅水溶液自由饮用1个月,可引起其心肌酶谱的异常,其机制可能是铅摄入引起心肌caspase-8和caspase-3表达升高作用的。但本研究也有一定的局限性,这主要是因为慢性铅中毒是一个缓慢的过程,在其进展中可能涉及多种信号通路调控,具体为哪条信号通路调节作用的仍需进一步明确。

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