质谱技术在出生缺陷防控中的应用

李增明

（江西省妇幼保健院，南昌 330006）

出生缺陷是指出生以前就已发生的身体功能上、结构上，或代谢的异常，出生缺陷是导致死胎、流产、婴幼儿死亡和先天性残障的主要原因之一，预防和减少出生缺陷，是提高出生人口素质、实施健康中国行动和夺取脱贫攻坚全面胜利的内在要求。为了降低出生缺陷发生率，WHO 提出了出生缺陷的三级预防策略[1,2]。出生缺陷发生的原因主要包括遗传因素、环境因素以及遗传环境两因素相互作用，建立高灵敏度、高特异性、高通量和稳定性好的出生缺陷风险评估预测、筛查、诊断和鉴别诊断及成因因素分析检测方法，对于出生缺陷的防控具有重要意义[3,4]，质谱分析的精准定性定量特性使得其可为出生缺陷的筛查、诊断和鉴别诊断和成因分析提供科学依据，因此质谱技术在出生缺陷防控中发挥着重要作用。现对质谱技术在出生缺陷防控中的应用进展进行综述，以期为质谱技术在出生缺陷风险预测、筛查、检测和诊断中的进一步应用提供参考。

1 质谱技术概述

质谱是众多分析技术中同时具备了灵敏度高、特异性好、响应速度快的普适性分析检测方法，在诸多分析测试领域均有非常广泛的应用。目前已有13 个诺贝尔奖授予了与质谱技术的诞生和发展以及有关应用方面的研究。2002 年，美国芬恩教授和日本田中耕一教授发明了生物大分子质谱分析法，获得诺贝尔化学奖[5]。

质谱技术由于其在灵敏度和特异性上的突出优势，适合于复杂临床生物样本的分析检测，该技术在临床检测和诊断领域的发展尤为迅猛。目前质谱技术除了已成为临床小分子化合物的主要质控参考方法外，在临床内分泌、治疗药物监测、新型生物标志物发现分析等临床检测领域应用越来越广泛，可为疾病的诊断提供准确可靠的临床依据，在临床检测诊断领域发挥愈来愈重要的作用。质谱分析的精准定性定量特性在临床分析特别是在精准医疗方面提供了快速可靠的解决方案。目前质谱技术的临床应用主要是对人体的体液 （如血液、尿液、唾液等）和人体组织切片的分析，揭示疾病的相关信息，对生理病理研究和临床诊断具有重要意义。质谱技术在出生缺陷风险预测、筛查、检测和诊断中的应用具有如下优势：质谱技术具有突出的特异性；灵敏度高也是质谱技术的另外一个突出优势；质谱技术具有多通道检测能力，可以同时检测多种化合物，因此通量较高，所需样本量少。

2 质谱技术在出生缺陷一级预防中的应用

出生缺陷的一级预防手段主要是通过婚前、孕前医学检查和胚胎植入前遗传学诊断 （Preimplantation Genetic Diagnosis，PGD）实现。通过婚前、孕前筛查和PGD 防治出生缺陷，国内外都有成效显著的先例。针对遗传相关的出生缺陷，以单细胞高通量检测方法为核心的PGD 技术，相关技术进一步临床应用转化，构建新型、主动、精准且高效的遗传性出生缺陷孕前发现诊断、胚胎植入前即可阻断的出生缺陷防控新模式，创建有特色优生和防控关口前移的新模式。PGD 技术是对胚胎或极体或卵子行卵裂球/滋养层细胞进行活检，开展染色体和/或基因组学筛查检测，检测结果可提示胚胎携带的遗传变异情况，进而疾病的精准分类和精准诊断，选择未携带基因和染色体异常的胚胎植入子宫进而出生健康新生儿的方法。PGD 技术可以从根源上解决生育遗传性出生缺陷问题，其通过只移植健康胚胎，进而可以进行一级预防遗传相关出生缺陷新生儿的出生，可以避免产前诊断有创性操作导致的感染、出血以及流产等并发症发生，避免孕妇怀遗传病胎儿时经受的身心损害，并且彻底阻断了致病基因遗传，真正实现了优生优育，是目前临床精准医学应用的典范[6]。

在婚前孕前医学检查和PGD 中，脱氧核糖核酸分析对于遗传性出生缺陷的风险预警、筛查和检测非常重要，因此,建立和发展灵敏、快速、高效和精准的DNA 各种性质的分析方法具有重要意义。在20 世纪 80 年代末，Tanaka 等提出基体辅助激光解吸电离技术，并与飞行时间质谱相结合，产生了“软”电离的基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)，目前，MALDI-TOF-MS已被应用于脊髓性肌肉萎缩症基因检测、地中海贫血基因检测、G6PD 基因突变检测和叶酸代谢相关基因检测等[7,8]。传统的DNA 分析方法主要有荧光定量PCR、数值化PCR 和毛细管测序法，其缺点是通量较低单次分析检测的位点少，新兴的基因芯片法、二代测序和单分子测序用于DNA 分析优点是高通量且获得的信息量大，其缺点是成本高、周期长、操作复杂、解读难，而飞行时间质谱用于DNA 分析具有中通量且可以多基因多位点分析，具有准确、快速、经济的优点。

神经管畸形 ( Neural tube defects，NTDs) 是指神经管具有缺陷导致的严重先天性畸形，补充合适剂量的叶酸是降低NTDs 发病率的重要预防措施。然而，叶酸过量也存在一定的副反应：过量剂量的叶酸会掩盖进而加重维生素B12缺乏引发的相关症状，过量剂量的叶酸不适合预防NTDs，还可能会引发智力及发育障碍等。再者也不是所有的NTDs 通过补充叶酸都可以进行预防。因此叶酸及其代谢产物的分析检测对于NTDs 风险预测和评估及指导精准补充叶酸非常重要。黄敏等[9]建立了基于液相色谱质谱方法的叶酸及叶酸的代谢产物5-甲酰基四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、同型半胱氨酸、组氨酸和丝氨酸的检测方法并用于NTDs 的发病风险评估和预测具有很好的阳性预测值。

早期生命的各种影响因素是生命体出现疾病的最早影响因素，这种作用甚至可以决定个体未来的健康情况。Baker 等发表 “成人疾病胎源学说”，该学说认为宫内受到有害因素暴露或营养不良，会导致胎儿的组织器官在功能和结构上发生程序性或永久性改变，这些变化增加了出生缺陷的风险。目前我国环境污染形势严峻，孕前进行环境有害物质暴露水平的检测和评估对预防出生缺陷有重要意义。要准确真实评估环境有害物质暴露水平和剂量，首先得建立高灵敏度、高特异性、高通量且稳定性好的分析检测方法。质谱技术由于其在灵敏度和特异性上的突出优势，适合于复杂临床生物样本的分析检测，越来越受到重视。Yang BC 等[10]发展了固相基底电喷雾电离直接质谱技术，在无需样品预处理的情况下，以医用棉签取样后直接耦合在纳升电喷雾电离质谱仪上，实现了尼古丁和可替宁直接快速定性定量分析，1min 内可以完成一个样本的检测，大大提高了分析速度，节约时间的同时也节约了大量溶剂成本。经济飞速发展同时带来了城市机动车辆的快速增长，冬季燃煤取暖和机动车尾气排放造成的环境污染问题日益突出，多环芳烃化合物就是不可忽视的重点污染物之一。来自世界范围的多项研究发现人体尿液中多环芳烃代谢物检出率大于90%，提示人类普遍暴露于多环芳烃。近年来评估人体接触多环芳烃的暴露情况已成为新的研究热点，目前研究表明多环芳烃具有致癌、致突变和发育毒性，而孕妇作为易感人群，孕前及婚前进行多环芳烃暴露水平的评估对于指导生育具有重要意义，Yang BC 等[11]发展了固相微萃取-玻璃毛细管纳升电喷雾电离质谱技术，在无需样品预处理的情况下，实现了人尿液中多环芳烃六种代谢物的快速定性定量分析，1 分钟内可以完成一个样本的检测，大大提高了分析速度。

3 质谱技术在出生缺陷二级预防中的应用

产前筛查和产前诊断是预防出生缺陷的第二道防线。采用 PCR 技术、Sanger 测序技术、SNP array 和NGS 对羊水细胞或绒毛膜组织基因检测在遗传代谢缺陷病的产前诊断中发挥着重要作用，基因检测的优点是准确，可明确是患者、携带者或无携带，缺点是基因型和表型相关性问题：单个遗传基因座的不同突变可以不同的疾病，并且不同的个体中相同的突变可以引起不同严重程度的疾病。基因组学结果反映的是什么是可以发生的，转录组学结果反映的是什么是即将发生的，蛋白质组学结果反映的是什么是正在发生的，只有代谢组学结果才真正反映什么是已发生的，因此采用质谱方法检测羊水中代谢产物水平的变化有助于一些遗传代谢缺陷病的明确产前诊断，且羊水代谢产物检测分析速度更快。如在有机酸血症胎儿的产前诊断中，健康孕妇羊水里酰基肉碱水平和有机酸代谢产物浓度都很低，但怀有有机酸血症胎儿的孕妇羊水中这些酰基肉碱和有机酸代谢产物会显著增高，结合基因检测的结果和羊水气相色谱质谱代谢产物测定结果,有助于提高产前诊断的准确性。并且在不同孕期孕妇羊水中有机酸和酰基肉碱水平并无明显差异。韩凤等[12]探讨了气相色谱质谱联用技术及液相色谱质谱测定羊水中的有机酸即酰基肉碱水平用于丙酸血症胎儿产前诊断的应用价值。收集40 例进行产前诊断且生育过丙酸血症患儿的孕妇作为丙酸血症母亲组。从同期进行常规产前诊断孕妇中随机选取40例作为对照组。两组孕妇都是在妊娠16～20 周通过羊膜腔穿刺术抽取得到羊水，然后通过液相色谱质谱测定羊水丙酰肉碱和乙酰肉碱浓度,通过气相色谱质谱测定羊水中甲基枸橼酸和3-羟基丙酸浓度,羊水细胞进行基因检测。结果丙酸血症母亲组孕妇羊水丙酰肉碱和甲基枸橼酸水平均高于对照组,可利用串联质谱及气相色谱质谱技术检测羊水中的丙酰肉碱、甲基枸橼酸水平,对先证者为丙酸血症的孕妇进行产前诊断。

地中海贫血是世界上最常见的单基因遗传病之一，通过二级预防产前诊断是地中海贫血防控的重要措施之一，母血浆胎儿游离核酸的发现为地贫的无创性产前诊断提供了新的途径。近些年来,飞行时间质谱分析已应用于针对地贫遗传缺陷(特别是β 地贫点突变)的母血浆胎儿游离DNA 检测[13]。

4 质谱技术在出生缺陷三级预防中的应用

新生儿筛查是预防出生缺陷的最后一道防线。1990 年时来自美国杜克大学的陈垣崇教授团队成员Millington 博士率先提出采用串联质谱技术开展新生儿遗传代谢性疾病的筛查[14]。1995 年时Rashed 等利用电喷雾电离质谱技术进行新生儿代谢性疾病的筛查，筛查出丙酸血症、短链及中链酰基辅酶A 脱氢酶缺乏症、甲基丙二酸血症等多种遗传代谢病[15]。电喷雾电离质谱技术是一种软电离技术，该技术与自动连续进样器联用，应用自动进样器提升了分析的速度和准确度，使得分析通量大大提升，为大规模进行新生儿遗传代谢病筛查奠定了有利条件，从此各新生儿疾病筛查实验室开始使用串联质谱技术进行新生儿遗传代谢病筛查。

采用串联质谱技术进行新生儿遗传代谢病筛查，其在2-3 分钟内对每个标本可同时测定几十种小分子代谢物，测定物质包括氨基酸及脂肪酸线粒体氧化代谢紊乱和有机酸障碍在内的40 余种遗传代谢性疾病，使得新生儿遗传代谢性疾病的筛查从“一次实验只能筛查一种疾病”向“一次实验可筛查多种疾病” 转变，质技术具有灵敏度高、、分析速度快且分析通量高的优点，质谱技术应用于新生儿遗传代谢病筛查不仅增加了筛查疾病的病种，还大大提高了筛查的速率及筛查的准确性和特异性，进而使得新生儿遗传代谢病的筛查进入到新纪元。

串联质谱技术通过联合二级检验指标能够有效地改善传统筛查性能。比如，先天性肾上腺皮质增生症常规筛查的生物标志物是17α-羟孕酮，但假阳性率很高。Minutti 等[16]发展了基于 液相色谱质谱联用技术同时测定血斑中雄烯二酮、17α-羟孕酮等类固醇类物质，这种二级筛查能够识别常规筛查中的假阳性结果。11β-羟化酶缺陷症引发的先天性肾上腺皮质增生症较为罕见，其不是新生儿遗传代谢病筛查检测的主要疾病。然而标准的免疫实验检验中，患儿的17α-羟孕酮水平会轻度增加。Peter 等[17]发展了基于 液相色谱质谱联用技术对通过免疫测定法发现的17α-羟孕酮浓度增高的患儿的血片进行二级筛查检测，结果发现这种血片中雄烯二酮和11-脱氧皮质醇水平升高，而皮质醇浓度降低，结合家族病史即可诊断为11β-羟化酶缺陷症。通过滤纸干血斑检测总高胱氨酸水平已成为现实，就是在出生后3 天内采滤纸干血斑，这种检测方法的敏感性还可达到100%，因此可以发展为新生儿高胱氨酸尿症检测首选方法。再而，串联质谱遗传代谢病的阳性筛查结果不仅仅是一种代谢物的水平的变化，还可以多指标提示，这大大提高了遗传代谢病筛查的特异性和敏感性，使得筛查检出率比临床诊断更高。

采用气相色谱-质谱联用技术检测尿液中有机酸水平对于有机酸血症等遗传代谢缺陷病的筛查、诊断和鉴别诊断具有重要作用，与串联质谱检测滤纸干血斑中的氨基酸肉碱水平相比，气相色谱-质谱联用技术检测尿液中有机酸水平操作复查，通量较低，限制了其大规模开展，下一步有必要研发简便快速高通量准确的尿液中有机酸水平质谱分析检测方法。

溶酶体贮积症由于基因突变引发转运蛋白或溶酶体酶缺乏进而造成底物在溶酶体内聚集而引发的一类遗传代谢疾病，多数为常染色体隐性遗传，也有部分为X 染色体连锁遗传。溶酶体贮积症会损伤全身多种器官，首先是中枢神经系统，溶酶体贮积症的临床症状具有进行性发展特点，如果没有及时治疗或许引发患者死亡或终身残疾。我国大陆目前还没有进行新生儿溶酶体贮积症的群体筛查，造成许多溶酶体贮积症患儿无法早发现早治疗，因此开展新生儿溶酶体贮积症群体筛查有重要意义。溶酶体贮积症的群体筛查方法主要有：质谱技术、多免疫定量法和荧光法。荧光法由于非特异性其不能同时测定多种酶的活性因此假阳性高，多免疫定量法目前还没批准试剂盒，而质谱技术具有准确度高、灵敏度好且一次检测筛查发现多种疾病，因而在溶酶体贮积症群体筛查中有优势。万智慧等[18]利用串联质谱技术检测6 种溶酶体贮积症：戈谢病、尼曼匹克病A/B、克拉伯病、黏多糖贮积症I 型、法布里病和庞贝病的筛查指标，评估质谱方法用于新生儿6 种溶酶体贮积症筛查的可行性。结果表明质谱方法适用于6 种溶酶体贮积症的新生儿筛查，也可用于相关6 种溶酶体贮积症患者治疗后的酶活监测，为串联质谱法筛查溶酶体贮积症奠定了基础。

我国现在残疾人8296 万，其中听力障碍人群高达2780 万。遗传因素是致聋的主要因素之一，新生儿物理听力筛查联合耳聋基因筛查是防聋控聋的最佳策略。付华钰等[19]比较了芯片法和飞行时间质谱法在非综合征性耳聋基因筛查中的应用，发现两种方法检测结果并无显著差异，飞行时间质谱技术的检测位点多且检出率高，这在一定程度可减少漏筛率，在大规模人群耳聋基因筛查中有其优势，但飞行质谱方法方法所需的仪器设备成本较高，对检测人员的专业水平要求较高。

5 结语

质谱技术在出生缺陷三级预防中均有所应用，但应用最为广泛的是串联质谱新生儿遗传代谢病筛查，其优势在于操作方便、高通量、筛查病种多。质谱技术优势是灵敏度高、特异性好、可多通道检测同时检测多种化合物。质谱技术出生缺陷的进一步应用存在一些瓶颈，如影响结果可靠性和重现性的因素多；如基质效应、干扰、源内变构及方法标准化跟免疫法比较，质谱法自动化程度还是很低，需要样品处理和色谱分离，手工操作难以避免，难以实现随机插入同时也面临法规上的瓶颈；如相关规范性文件和收费标准。