2018 年山西省儿童医院流感嗜血杆菌的分布及耐药情况分析

陈珊珊， 朱 镭， 郭 超， 徐 辉， 郭琳琳， 王颖颖， 孟晋华

流感嗜血杆菌是儿童社区获得性感染的常见病原菌，仅次于肺炎链球菌。该菌主要引起儿童呼吸道感染，其次可引起患儿中耳炎、蜂窝组织炎、关节炎、化脓性脑膜炎、血流感染等多种疾病，严重威胁儿童的身体健康[1-2]。近年来，随着抗生素在临床的广泛应用，流感嗜血杆菌的耐药菌株逐渐增多。流感嗜血杆菌对氨苄西林耐药率也逐年上升，耐药程度日益严重[3]。本研究通过对山西省儿童医院2018年患儿临床分离的1 320株流感嗜血杆菌进行回顾性调查研究，分析其分布、流行特点及耐药情况，为临床经验诊治提供科学依 据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 2018年1-12月山西省儿童医院微生物室在患儿各类标本中共检出流感嗜血杆菌 1 320株（剔除同一患儿相同部位的重复菌株）。

1.1.2 试剂及仪器 菌株分离采用巧克力平皿，药敏试验采用HTM培养基，均购自郑州安图生物公司，血培养瓶和脑脊液培养瓶分别由法国梅里埃公司和美国BD公司提供。采用质谱仪鉴定流感嗜血杆菌，仪器购自法国梅里埃公司。β内酰胺酶检测的头孢硝噻吩纸片为英国OXOID公司产品。药敏试验选用9种抗菌药物，药敏纸片均购自英国OXOID公司。

1.1.3 质控菌株 流感嗜血杆菌质谱鉴定质控菌株为大肠埃希菌ATCC 8739，药敏试验质控菌株为流感嗜血杆菌ATCC 49247。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离和鉴定 按照操作规范，将经过评估合格的痰标本及其他各类标本以分区划线法接种于血平皿和巧克力平皿，置 35 ℃、含 5% CO2培养箱中培养16～24 h，挑取巧克力平皿上圆形透明或半透明、湿润、边缘整齐的可疑流感嗜血杆菌菌落，接种于巧克力平皿上，35 ℃、5% CO2孵育24 h。24 h后采用质谱仪鉴定分纯菌株，置信区间在99.0%～99.9%内可鉴定为流感嗜血杆 菌。

1.2.2 药敏试验 采用纸片扩散法（K-B法）对9 种抗菌药物进行药敏试验，并按照2017年美国临床与实验室标准化协会（CLSI）推荐的标准进行结果判读[4]。β内酰胺酶检测采用头孢硝噻吩纸片刮取平皿上少量菌落，若1 min内纸片变红则为产酶阳性，若不变红则为阴性。

1.2.3 统计分析 使用WHONET 5.6和SPSS 20.0软件进行数据处理和统计分析。P＜0.05为差异有统计学意 义。

2 结果

2.1 菌株分布

2.1.1 性别、年龄分布 分离的1 320株流感嗜血杆菌中，分离自男性患儿735株（55.7%），女性患儿585株（44.3%）。分离自1岁以下婴儿510株（38.6%），1～3岁534株（40.5%），4～6岁157株（11.9%），7～16岁119株（9.0%）。

2.1.2 门诊和住院患者分布 1 320株流感嗜血杆菌分离自住院患者为92.0%（1 214/1 320），106株分离自门诊患者（8.0%），且主要分离自女性患儿阴道分泌物，占83.0% （88/106）。

2.1.3 季节分布 流感嗜血杆菌主要在冬春季流行，共分离907株，占全年1 320分离株的68.7%，其次为夏季，246株（18.6%），而秋季最少，为167株（12.7%）。见图1。

2.1.4 标本类型分布 检出的1 320株流感嗜血杆菌主要来自痰液标本（痰标本由吸痰器吸得且涂片合格），占90.1% （1 189/1 320），其次为阴道分泌物，占6.7%（88/1 320）。此外，肺泡灌洗液13株（1.0%），脓液标本20株（1.5%），血液标本6株（0.5%），脑脊液和尿液标本各2株，分别占0.2%。其中血和脑脊液标本同时分离出流感嗜血杆菌1例，阴道分泌物和尿液标本同时检出者2 例。

2.2 β内酰胺酶检测和药敏试验

2.2.1 β内酰胺酶检测结果 剔除同一患者不同部位重复菌株后，分离的1 317株流感嗜血杆菌中，β内酰胺酶阳性株733株，占55.7%，β内酰胺酶阴性氨苄西林耐药株（β-lactamase-negative and ampicillin-resistant，BLNAR）89株，占6.8%（89/1 317）。

图1 流感嗜血杆菌季节分布情况Figure 1 Seasonal distribution of Haemophilus infl uenzae isolates

表1 2018 年1 317 株儿童流感嗜血杆分离株菌对抗菌药物的敏感率和耐药率Table 1 Antimicrobial susceptibility of 1 317 Haemophilus inf luenzae isolates from children in 2018（%）

2.2.2 药敏试验结果 分离菌株对抗菌药物的药敏结果见表1。未检出对第三代头孢菌素、美罗培南、左氧氟沙星不敏感的流感嗜血杆菌。

经统计学分析，使用χ2检验比较β内酰胺酶阳性氨苄西林耐药组（β-lactamase-positive and ampicillin-resistant，BLPAR）、β内酰胺酶阴性氨苄西林敏感组（β-lactamase-negative and ampicillinsensitive，BLNAS） 以及BLNAR组药物敏感率，发现三者对阿莫西林-克拉维酸（χ2= 258.0，P＜0.01）、头孢呋辛（χ2=180.5，P＜0.01）、阿奇霉素（χ2= 143.0，P＜0.01）、甲氧苄啶-磺胺甲唑（χ2=19.9，P＜0.01）耐药率差异有统计学意 义。

3 讨论

本研究显示2018年我院儿童患者流感嗜血杆菌的分离株较多，计1 320株，较2017年（837例）有所升高。分析原因如下：①门诊标本送检数量有所增加，尤其是女童阴道分泌物标本。近年来，我院患儿阴道分泌物流感嗜血杆菌检出率有所提高，门诊医师逐渐意识到阴道分泌物标本送检的重要性。2018年流感嗜血杆菌占门诊儿童阴道分泌物主要分离菌第1位。此外，住院患儿痰标本中流感嗜血杆菌的检出率也有大幅提升；②临床医师微生物标本的送检意识提高，对标本采集要求也有了一定认识，特别是尽量在抗菌药物使用前送检标本；③对本室工作人员加强培训，提高了微生物室人员对流感嗜血杆菌鉴别分离的能力；④本室选择多家培养基进行比对试验，采用流感嗜血杆菌生长最佳的巧克力培养基，使流感嗜血杆菌的初筛分离率得到显著提高；⑤对脑脊液常规检测的异常标本除采用脑脊液培养瓶培养外，将离心后的沉淀物接种至血平皿及巧克力平皿培养，此外，对于镜下形态高度怀疑流感嗜血杆菌或血培养检出流感嗜血杆菌但脑脊液未报阳者及时向脑脊液培养瓶中添加新鲜血液，提高了脑脊液流感嗜血杆菌的检出率。

本研究中男性患儿流感嗜血杆菌感染所占比例稍高于女性患儿，提示男性儿童可能较易受该菌感染，与甄杨等[5]、程薇等[6]的报道结果一致。年龄分布显示，我院流感嗜血杆菌感染患儿以3岁以下婴幼儿为主，占79.1%，可能与其肺功能及免疫系统发育尚未健全有至关重要的关系。因此，需要及时接种流感嗜血杆菌疫苗，预防流感嗜血杆菌感染的发生。多个研究显示，流感嗜血杆菌感染呈明显的季节性分布，好发于冬春季[7-8]。本组资料显示，我院冬春季共检出907株流感嗜血杆菌，占全年分离株的68.7%，可能与北方冬春季寒冷空气使儿童黏膜局部免疫受损有关。

流感嗜血杆菌是条件致病菌，常定植于正常人鼻咽部，以学龄前儿童的定植率最高，当机体抵抗力降低时，可侵入下呼吸道引起感染[9]。本研究显示流感嗜血杆菌主要分离自下呼吸道，其中痰标本最多，占总分离株的90.1%（1 189/1 320），肺泡灌洗液共检出13株。阴道分泌物是除呼吸道标本外比率较高的标本类型，共分离出88株，占总分离株的6.7%。患儿年龄范围为7个月龄～11岁，主要集中在3～7岁学龄前儿童。有国外报道称流感嗜血杆菌是引起青春期前女孩外阴阴道炎的最常见致病菌[10]，国内卢文敏等[11]研究发现流感嗜血杆菌占阴道炎患儿阴道分泌物分离株的第2位，仅次于大肠埃希菌。本研究显示，我院儿童阴道分泌物培养的致病菌中，流感嗜血杆菌的检出率居首位，与钟华敏等[12]结果一致。中耳炎、外科创伤等脓性分泌物中所占比例仅次于阴道分泌物，占1.5% （20/1 320）。值得关注的是，尿液标本共检出2例，且这2例患儿阴道分泌物均检出流感嗜血杆菌。

氨苄西林曾是治疗流感嗜血杆菌感染的首选药物。近年来，随着抗生素的广泛应用，流感嗜血杆菌对氨苄西林的耐药率逐渐升高，耐药程度也日益严重[3]。本组资料显示2018年我院流感嗜血杆菌对氨苄西林耐药率高达62.5%。目前，公认的流感嗜血杆菌对氨苄西林耐药机制主要有两种，其中产β内酰胺酶是其最常见的作用机制[13]。非产β内酰胺酶的流感嗜血杆菌对氨苄西林耐药可由ftsI基因点突变影响青霉素结合蛋白（PBP），使PBP对抗生素的亲和力降低，此种耐药株称为BLNAR株[14]，本研究检出89株，仅占6.8%（89/1 317），提示我院2018年流感嗜血杆菌对氨苄西林的耐药机制仍以产β内酰胺酶为主，氨苄西林已不再适合作为治疗流感嗜血杆菌感染的首选药物。此外，统计分析显示β内酰胺酶阳性菌株对阿莫西林-克拉维酸、头孢呋辛、阿奇霉素和甲氧苄啶-磺胺甲唑的敏感率明显低于β内酰胺酶阴性菌株。

本研究数据显示流感嗜血杆菌对头孢呋辛的耐药率为32.3%，较2017年（29.5%）和2016年（27.5%）有所上升。这一结果提示对于部分轻中度感染的患儿在第二代头孢菌素类抗生素经验用药前应及时送检疑诊感染部位的标本，同时应密切注意患儿的体征改变和临床微生物室检验报告，转为目标治疗。阿莫西林-克拉维酸作为常用的口服抗生素，细菌对其敏感率较高，为92.8%，罕见对头孢曲松、头孢噻肟不敏感株，敏感率达100%，说明我院流感嗜血杆菌分离株对第三代头孢菌素和含酶抑制剂的复合制剂保持较高敏感率，可作为经验性治疗的首选药物。此外，未发现对美罗培南的不敏感株，提示碳青霉烯类对流感嗜血杆菌有较强的抗菌活性，但并不主张将其作为治疗的首选药物，以避免抗菌药物耐药性的产生。所有菌株中未见左氧氟沙星的不敏感菌株，这可能与儿童患者因用药安全问题很少选择该种抗菌药物有关。分离株对阿奇霉素的非敏感率为28.8%，敏感率为71.2%，与CHINET 2017年儿童株流感嗜血杆菌阿奇霉素26.1%的非敏感率较为接近[15]。在所有抗菌药物中对甲氧苄啶-磺胺甲唑的耐药率最高，达67.0%，临床不宜选用。

综上所述，我院流感嗜血杆菌菌株主要来自下呼吸道，3岁以下婴幼儿为易感人群，冬春季为感染高发季节。菌株对氨苄西林的高耐药率与β内酰胺酶高产酶率有关，使得氨苄西林已不能作为临床一线用药。临床医师在经验性治疗时可首选第二代、第三代头孢菌素和加酶抑制剂的复合制剂，但因第二代头孢菌素如头孢呋辛的耐药率有逐年上升的趋势，应在用药前尽快送检患儿可疑感染部位的标本并及时根据微生物室提供的药敏结果合理选择抗菌药物。这样不仅有利于患者疗效的提高，也利于控制临床耐药菌株的增长速度。