碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌分子流行病学分析

宋羽希， 王 琴， 胡 健， 朱忠立， 黎俊雅， 向朝雪， 李福祥，

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集本院2015年1月-2018年12月临床各种标本分离出CRE 121株（剔除同一患者分离的重复菌株）。CRE纳入标准为 2015年美国疾病控制与预防中心颁布的标准（ 见《医疗机构耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌防控指南》），即亚胺培南MIC≥ 4 mg/L 和/或厄他培南MIC≥2 mg/ L。所有细菌均由VITEK 2-Compact全自动微生物分析仪进行鉴定和体外药敏试验。药敏结果根据CLSI判断标准。质控菌株：大肠埃希菌 ATCC 25922、阴沟肠杆菌 AT C C 7 0 0 3 2 3、肺炎克雷伯菌 ATCCBAA 1705，购自中国工业菌种保藏所。

1.1.2 仪器和试剂 VITEK 2-Compact全自动微生物分析鉴定仪、GNI鉴定卡、AST-GN13药敏卡均为法国生物梅里埃公司产品；细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生物有限公司；PCR、凝胶电泳（Marker DL2000）试剂均购自北京擎科生物科技有限公司；PCR仪购自美国Applied Biosystems公司；电泳仪、凝胶成像仪购自北京君意东方有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 基因检测 细菌DNA提取严格按照提取试剂盒（DP302）说明书操作。相关扩增引物由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列见表1[3-7]。 13种相关耐药基因检测反应总体系均为：总体积50 μL，其中PCR Master MIX 25 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL，双蒸水22 μL。PCR反应条件为：98 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸 10 s，36个循环，最后72 ℃ 延 伸 5 min。PCR扩增产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶成像系统拍照。最后，阳性扩增产物送北京擎科生物科技有限公司完成测序。 序列比对使用Chromas软件查看测序图，测序结果文本序列用MegAlign软件直接作BLAST Search比对，以证实扩增产物为目的基因片段。

表1 PCR 引物序列及扩增片段Table 1 PCR primer sequences used in this study and the corresponding ampilied fragments

1.2.2 肠杆菌科基因间重复一致序列P C R（E R I C-P C R） 使用E R I C-P C R 对同种属的细菌进行同源性分析。E R I C 1：5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'，ERIC2：5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3'。结果判读：同源性菌株扩增条带位置完全相同则具有同一ERIC基因指纹图谱；主条带位置相同，副条带相差1～2条则为亚型；不符合上述条件者则具有不同ERIC基因指纹图谱，判定为非同源性菌株[3]。

1.2.3 临床资料 收集CRE分离株感染患者的人口学资料（包括性别、年龄、入住科室、分离标本）、合并症（糖尿病、急慢性心功能衰竭、慢性呼吸系统疾病、终末期肾病透析、肝硬化、肿瘤）、过去30 d手术史及内镜检查史、过去2周侵袭性操作（气管插管/气管切开、机械通气）及ICU入住史、CRE感染患者28 d死亡率。感染诊断标准：肺炎诊断标准根据国家卫生行业标准（WS382-2012）；泌尿系统感染、血流感染、腹部脏器感染、伤口软组织感染均参考2001年卫生部医院感染诊断标准[8]。

1.2.4 统计学分析 数据采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，正态分布计量资料采用均数±标准差表示，计数资料采用n（%）表示。

2 结果

2.1 菌种分布

121株CRE中检出最多的为耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP），其次为大肠埃希菌和阴沟肠杆菌。见表2。

表2 121 株CRE 菌种分布Table 2 Species distribution of 121 carbapenem-resistant Enterobacteriaceae strains[n（%）]

2.2 菌株来源

取自呼吸道标本56株（46.3%），尿液24株（19.8%），血液14株（11.6%），胆汁8株（6.6%），伤口分泌物6株（5.0%），其他无菌体液13株（10.7%）。

2.3 科室分布

C R E 分离自住院患者11 8 株，门诊3 株。121株中干部ICU 19株（15.7%），普外科18株（14.9%），神经外科16株（13.2%），干部病房11株（9.1%），重症医学科8株（6.6%），康复科6株（5.0%），其余40株（33.1%）分布在其他18个病区。

2.4 药敏试验结果

121株CRE对青霉素、头孢菌素类抗生素耐药率高，对阿米卡星的耐药率最低。见表3。

2.5 基因检测结果分析

2.5.1 耐药基因检测 121株CRE中，产碳青霉烯酶肠杆菌（CPE）96株（79.3%），其中携带blaKPC基因65株（67.7%），blaNDM-1基因25株（26.0%），blaOXA-48基因7株（7.3%），blaVIM基因2株（2.1%），同时携带2种基因3株（3.1%）。121株中携带blaSHV基因56株（46.3%），blaTEM基因57株（47.1%），blaDHA基因45株（37.2%）。未检测到blaGES、blaIMP基因。见表4。部分基因电泳结果见图1、2。

2.5.2 膜孔蛋白基因检测 52株大肠埃希菌、阴沟肠杆菌和产气克雷伯菌中，OMPF缺失/突变25株（48.1%），OMPC缺失/突变44株（84.6%）。56株肺炎克雷伯菌中，OMPK35缺失/突变20株（35.7%），OMPK36缺失/突变51株（91.1%）。见表5。

2.6 同源性分析

ERIC-PCR电泳结果显示56株CRKP大致具有5种不同类别的指纹图谱，其中A型40株、B型5株、C型7株、D型2株、E型2株；26株耐碳青霉烯类大肠埃希菌大致有3种类型的指纹图谱，A型14株、B型8株、C型4株；23株耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌大致有3种类别的指纹图谱，A型13株，B型3株，C型7株。

表3 CRE 对常用抗菌药物的敏感率和耐药率Table 3 In vitro susceptibility of 121 carbapenem-resistant Enterobacteriaceae strains to antimicrobial agents[n（%）]

表 4 CRE 碳青霉烯酶基因携带情况Table 4 Carbapenemase genes identif ied from CRE strains[n（%）]

图1 blaKPC 基因PCR 电泳结果Figure 1 Partial electrophoretic results of the amplicons after PCR ampilication of blaKPC gene

图2 blaNDM-1 基因PCR 电泳结果Figure 2 Partial electrophoretic results of the amplicons after PCR ampilication of blaNDM-1 gene

表5 大肠埃希菌和肠杆菌属细菌外膜蛋白改变情况Tabel 5 Outer membrane porin in Escherichia coli and Enterobacter species[n（%）]

2.7 CRE检出患者的临床信息

121例CRE检出患者中， 3例为门诊患者，有2例呼吸内科为肺炎克雷伯菌，泌尿外科1例为阴沟肠杆菌。118例住院患者中男85例（72.0%），女33例（28.0%），年龄为9 ～106岁，平均（65.1±20.0）岁。其余临床特征见表6。

表6 118 例住院CRE 检出患者的临床特征Table 6 Clinical details of 118 patients with carbapenem-resistant Enterobacteriaceae isolates（%）

表6 （续）Table 6（continued）（%）

3 讨论

本研究中CRE细菌主要为CRKP，且2018年检出率明显增高，是2015-2017年CRKP总和的4倍，这与CHINET监测数据中CRKP检出率趋势一致[9]。本院CRE携带碳青霉烯酶基因以blaKPC为主，其次为blaNDM-1，这与国内外多篇报道相似[10-11]。96株产碳青霉烯酶菌中7株携带blaOXA-48基因，OXA-48耐药基因最早于2001年在土耳其被发现，随后很快引起医院内暴发流行，有研究表明OXA-48基因比KPC、NDM基因更易于在肠杆菌科细菌中播散[12]。产VIM酶的CRKP最早于2001-2003年在南欧被发现，本研究发现的2株携带blaVIM基因的细菌均为肺炎克雷伯菌。部分CRE不仅携带碳青霉烯酶基因，还同时合并膜孔蛋白缺失或突变，可见CRE的多重耐药是多机制的共同作用导致。2株CRE未检测到相关耐药基因及膜孔蛋白缺失突变现象，其可能携带本研究未检测到的耐药基因。

ERIC-PCR是通过扩增肠杆菌科细菌基因组中所特有的一段基因间重复序列，产物通过核酸电泳获得条带，再通过比对电泳条带分类，适合同源性初步筛查。本次ERIC-PCR结果显示部分菌株同源性非常高，表明我院CRE存在克隆传播现象，应当引起重视。

肠杆菌科细菌是人体重要条件致病菌，本研究检出的CRE中有45株考虑为定植，但有研究报道，CRE定植患者有10%～30%概率发生感染，同时CRE定植者也是潜在的播散者[13]。本研究还发现16.4%（12/73）患者在感染CRE前2周行内镜治疗，内窥镜设计结构复杂，需要深度消毒灭菌，否则会成为细菌传播的途径。本研究中，CRE感染患者总病死率为32.9%（24/73），其中血流感染的总病死率为35.7%（5/14），这与国内外报道结果基本一致[1，14-15]。

CRE细菌培养鉴定通常需要2～3 d，临床医师常常采取经验性治疗，但有大量关于CRE菌血症和脓毒症研究表明，不恰当的经验抗菌治疗与死亡率增加独立相关[16]，这强调了快速诊断和评估的重要性。CRE引起的感染治疗棘手，目前主要的治疗药物为多黏菌素、替加环素、氨基糖苷类抗生素，而多黏菌素耐药菌株的出现导致对CRE感染的治疗更加困难[17]。综上，针对CRE要以防控为主，医护人员需加强对耐药菌处理的相关知识，对高危人群进行早期筛查，医院需建立有效的监测体系，加强感控强度，做好医院感控防 护。