分子病理学技术在非小细胞肺癌诊疗中的应用

(青岛大学附属医院病理科，山东 青岛 266555)

病理学是介于临床与基础医学之间的桥梁学科，被喻为疾病最后诊断的“金标准”。病理学发展大体历经三个阶段：器官病理学、细胞病理学、分子病理学。随着分子生物学技术的发展以及分子生物学技术与传统病理学的融合，病理学发生了革命性的进步，进行了重新的整合，步入病理学的第三个阶段——分子病理学。分子病理学是病理学和多个学科相结合形成的一门新的分支学科，主要是从核酸和蛋白质等生物大分子水平研究疾病发生发展的机制，为疾病的诊疗提供依据[1]。

肺癌是全球发病率和致死率最高的肿瘤之一，非小细胞肺癌(NSCLC)是临床上最常见的类型，约占全部肺癌的85%。我国NSCLC的发病率大约为53.57/100 000，男性略高于女性[2]。晚期NSCLC 患者的传统治疗以第三代化疗药联合铂类药物化疗为主，但疗效已达平台期，中位总生存期(OS)约为8个月，2年生存率约为12%，患者很难再从中进一步获益[3]。分子病理学技术的发展，使NSCLC疾病发生发展机制的研究更深入和精细，使精准治疗成为可能，从而显著延长了患者的生存时间，提升了患者的生存质量。

目前与NSCLC诊疗相关的分子病理学技术包括免疫组织化学(IHC)技术、原位杂交(ISH)技术、聚合酶链反应(PCR)相关技术及生物芯片技术等。

1 IHC技术

1941年COONS[4]创立了细胞化学中的“免疫细胞化学”，使用荧光素标记的抗体成功检测到肺组织内的肺炎双球菌。经过几十年的不断发展，从最初的直接免疫荧光标记方法，逐渐发展为免疫荧光组织化学技术、免疫酶组织化学技术、亲和免疫组织化学技术和免疫金-银组织化学技术等。

IHC利用抗原与抗体特异性结合的原理，首先通过抗体识别组织细胞内的抗原(多肽和蛋白质)，然后再通过化学反应使抗体上标记的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色，最终对组织细胞内的抗原进行定位、定性及定量研究。该方法具有特异度及灵敏度高、定位准确、形态学与功能学相结合等优点，目前越来越多地用于临床病理诊断、肿瘤良恶性和转移瘤来源判断、预后评估及基础科学研究。在分子病理学技术中，IHC技术是评估蛋白质表达水平最简单、最实用的方法，不仅能进行半定量检测、细胞内定位，还能对蛋白质翻译后修饰情况(如蛋白质磷酸化等)进行检测。

在NSCLC中，IHC检测主要用来进行辅助诊断。对于形态学上不能明确的NSCLC手术样本，一般会用TTF-1、NapsinA、P40、CK5/6、P63对肺腺癌、肺鳞癌进行鉴别诊断[5-7]；对于晚期NSCLC的活检样本，也要尽可能地使用TTF-1、P40两个IHC指标对肺腺癌、肺鳞癌进行鉴别诊断[6-7]。除此之外，还可以利用IHC技术对NSCLC和其他的肿瘤进行鉴别诊断，比如神经内分泌癌、恶性间皮瘤等[7-9]。对于NSCLC来说，IHC检测除了可作为一种鉴别诊断的手段外，还可为靶向用药提供依据。中国临床肿瘤学会(CSCO)原发性肺癌诊疗指南中推荐可以通过Ventana免疫组化检测ALK融合来指导ALK抑制剂的应用。此外，还可以采用兔抗人EGFR L858R单克隆抗体和兔抗人EGFR E746-A750单克隆抗体检测NSCLC样本中的EGFR基因L858R和E746-A750del的突变状态，与荧光定量PCR法相比，两种方法对基因突变状态的检测具有较高一致性，因此对于没有条件进行PCR检测的医院，可以通过此种方法判断NSCLC患者能否进行酪氨酸激酶抑制剂治疗[10-11]。

2 ISH技术

ISH技术利用碱基配对的原理，首先使标记了标记物的核酸探针与组织细胞内的待测核酸杂交，然后再通过一系列的组织化学或者IHC方法使探针上的标记物显色，对待测核酸进行细胞内定位。ISH主要分为：基因组原位杂交(GISH)、荧光原位杂交(FISH)、多彩色荧光原位杂交(M-FISH)和原位PCR。除此之外，根据探针标记物的不同还可分为FISH、显色原位杂交(CISH)以及银染原位杂交(SISH)。

在NSCLC中，可以利用FISH来检测某个基因的拷贝数增多和结构变异情况。对于NSCLC的ALK基因的结构变异检测，FISH被认为是ALK检测的金标准，经常用于其他ALK检测方法的验证[12]。美国国立综合癌症网络(NCCN)肺癌诊疗指南推荐使用FISH技术进行ALK、ROS1、RET基因重排和MET基因扩增的检测。此外，M-FISH还被用于肺癌的早期诊断。肿瘤的发生发展多伴有遗传学改变，在许多实体肿瘤(包括肺癌)中经常能见到染色体数目变异(尤其是非整倍体)。因此，可以通过染色体数目变异检测实现对肺癌的早期诊断及肺癌与肺良性病变的鉴别诊断[13]。

3 PCR相关技术

PCR技术可以模拟体内DNA的天然复制过程，大量扩增微量DNA。PCR技术诞生不足40年的时间里得到了突飞猛进的发展，并衍生出了一系列的相关技术，如第一代测序、实时荧光定量PCR(qPCR)、数字PCR (dPCR)、第二代测序(NGS)技术等，这些技术在NSCLC的分子病理检测中发挥着重要作用。

3.1 第一代测序技术

第一代测序技术的萌芽早于PCR技术的发明。成熟的第一代测序技术主要包括化学降解法和双脱氧链终止法。目前应用最广泛的美国应用生物系统公司(ABI)3730系列自动测序仪利用的测序技术就是双脱氧链终止法，同时使用了毛细管电泳和荧光标记技术。第一代测序技术的出现使人类获得了探索生命遗传信息的能力。人类基因组计划(HGP)正是利用这种技术，成功完成了人类基因组30亿个碱基对的测序和人类基因图谱绘制，发现了大量肿瘤相关基因以及药物靶基因，极大地推动了生命科学的研究进展[14]。美国重大科研项目——“癌症基因组图集”(TCGA)计划极大的丰富了NSCLC的基因图谱。Sanger测序法作为最经典的第一代测序技术，具有测序读长长、准确性高的特点，是最早应用于EGFR基因检测的一种技术，主要进行EGFR18～21四个外显子的测序，可以检测待测区域内的所有变异类型，尤其是一些稀有变异和未知变异，被当作是EGFR检测的金标准[15]。目前NSCLC相关的靶基因多达十几个，临床上需求更多的是进行多基因共检而不是单个基因的检测，因此Sanger测序已经不能很好地满足NSCLC基因检测的需求。但是，作为基因序列测定的金标准，Sanger测序经常会用于qPCR、普通PCR、NGS等方法的基因突变检测结果的验证。

3.2 qPCR技术

根据荧光标记方法的不同，qPCR技术可以分为荧光染料法以及荧光探针法。前者主要有Pico Green染料法和SYBR Green染料法，后者主要有水解探针法以及分子信标法等。水解探针法中应用最广泛的是TapMan探针法，即在PCR反应体系中加入了一个特异的荧光标记探针。分子信标法目前应用最多的是Scorpions突变阻滞扩增系统PCR(ARMS-PCR)法。ARMS技术主要是在引物序列的3′端人为添加错配碱基，增加扩增特异性，用于基因突变检测。TapMan探针法或ARMS技术均可以检测已知基因的突变，但相比较而言，ARMS检测方法具有更高的灵敏度以及特异度[16-18]。目前ARMS-PCR技术广泛地应用于NSCLC的EGFR、ALK、ROS1、BRAF、KRAS、NRAS等基因的检测，但是ARMS技术具有一定的局限性，只能检测已知基因变异，不能进行高通量检测，不能检测未知变异，同时对某些稀有变异和拷贝数变异也会出现漏检。另外，标本类型、肿瘤细胞含量、DNA浓度和质量、加样误差及气溶胶污染等问题也会影响ARMS检测结果的稳定性。

3.3 dPCR技术

dPCR的基本原理是“分而治之”。首先把样本分成很多份，少则几十份，多则几万份，然后平均分配到各个反应单元中，每个反应单元中的待测核酸数量符合泊松分布，包含零个到多个待测核酸，理想状态下为1个。待测核酸在每个反应单元中独立地进行PCR扩增。扩增结束后，对每个反应单元的荧光信号进行检测，根据泊松分布和荧光信号阳性的反应单元占比来计算待测核酸序列的拷贝数。在dPCR反应中荧光信号的产生过程基本与qPCR相同。dPCR主要分为微反应室/孔板dPCR、微流控芯片dPCR(cdPCR)以及微滴dPCR(ddPCR)三大类dPCR。后两种则是目前主要的商业化的dPCR技术。ddPCR技术以美国Bio-Rad公司的QX200系统以及美国Raindance Technogies公司的RainDrop为代表。cdPCR技术以美国Fluidigm公司的BioMark HD系统以及美国Life Techonolgy公司的QuantStudio 3D系统为代表。

dPCR具有高灵敏度、高精确性、高耐受性和绝对定量的优点，因此特别适合用于稀有基因变异检测、拷贝数变异分析和复杂样本基因表达研究等。对于NSCLC获得性耐药患者的循环肿瘤DNA的T790M突变情况的检测，ddPCR方法的检出率要明显高于ARMS技术[19]，因此ddPCR技术特别适合于对NSCLC患者用药后的动态监测。

3.4 NGS

NGS又称为高通量测序，其具备Sanger检测技术所没有的高性能——高通量、快速、高准确性以及低成本等优点。NGS主要包括有全基因组测序(WGS)、全外显子组测序(WES)以及目标区域测序(TRS)。与传统检测方法相比较，WGS可以在全基因组水平上检测基因变异，涉及人类所有基因，能及时发现未知变异，更好地完善NSCLC相关基因图谱。SHAO等[20]利用Ion Torrent平台进行靶向下一代测序，在 58例临床病例中发现了与肺腺癌相关的突变谱。但是临床上对于NSCLC患者选择靶向用药或者预后预测方面，用的更多的是TRS技术，这主要是因为NSCLC的基因变异主要集中在EGFR、ALK、ROS1、RAS、BRAF、RET、HER-2等基因上，而且部分基因还存在热点突变，比如EGFR的热点突变主要集中在19～21外显子区域。除此之外，NGS技术还可以用于肿瘤组织突变负荷(TMB)检测，用于预测NSCLC患者能否从免疫治疗中获益。据相关文献报道，TMB高的患者，与单纯的化疗相比，免疫治疗可以明显地提高无进展生存期(PFS)和OS[21-22]。

4 生物芯片技术

生物芯片技术是指采用原位合成法或点样法等方法，将组织、细胞或核酸、蛋白质、糖类等生物大分子固定于固相载体上构成高密度微阵列，通过相应的检测系统实现对生物样品的分析，具有快速高效、高并行性、高通量、微型化、自动化以及成本低等优点[23]。生物芯片主要有基因芯片、蛋白质芯片和组织芯片等。美国Affymatrix公司研发的基因芯片标志着生物芯片的诞生。基因芯片技术是分子生物学与计算机技术、高分子化学合成技术、微电子技术等多学科相互结合形成的一门新型生物学技术，可用于基因表达图谱的绘制，探索疾病发生发展的机制、发现诊疗相关的靶基因，阐述基因功能，辅助蛋白组计划的实施。此外，基因芯片还可以用于检测基因多态性及基因变异。蛋白质芯片是研究蛋白质组学的有力工具，主要有蛋白质检测芯片和蛋白质功能芯片两大类。在临床医学研究中,研究者经常利用蛋白质芯片技术寻找新的肿瘤标志物用于肿瘤早期的诊断和预后评估，如WANG等[24]利用C-12多肿瘤蛋白质芯片检测系统对224例肺癌患者、159例肺良性病变的患者以及90例健康者进行了血清CA125、CA19-9、铁蛋白、CA15-3、CA242、CEA、AFP、NSE、PSA、f-PSA、HGH、β-HGH的检测，发现肺癌组织C-12的阳性率为77.23%,高于肺良性病变的组织(13.84%)和健康对照组织(9.76%)。除此之外，蛋白质芯片也可以用于对NSCLC发病机制的研究，如VANMETER等[25]利用反向蛋白质芯片技术研究EGFR突变以及其磷酸化引起NSCLC发病的具体信号机制，发现EGFR突变患者的细胞群体中EGFR Tyr-1148以及Tyr-1068同时上调，而HER2 Tyr-1248和EGFR Tyr-1045同时下调，认为细胞癌变可能与以上因素引起的PI3K/AKT/mTOR等信号通路持续激活、EGFR泛素化速率和转化抑制能力降低有关。组织芯片结合了分子生物学和组织形态学的优势，主要用于各类原位组织技术实验，结合IHC、ISH、原位PCR等技术，可以针对细胞、核酸以及蛋白质等进行形态学与功能学的研究[26-27]。在NSCLC研究方面,组织芯片技术主要用于疾病的病因学研究、诊断、鉴别诊断、治疗和预后评估, 同时通过这一技术还可进一步发现与肺癌相关的特异性基因表达产物和免疫标记物。

随着医学和分子生物学的发展，越来越多的分子病理学技术应用于NSCLC的诊疗中，为NSCLC患者提供靶向治疗和免疫治疗的依据，从而极大地延长了患者的OS和PFS。但是由于受到技术、成本的限制以及试剂、样本局限性等的影响，某些分子病理学技术(如NGS、生物芯片技术等)在医院病理科的开展受到一定的限制，因此后续应该致力于优化技术、简化实验流程、降低成本，使更多的分子病理学技术能应用于临床诊疗，真正地服务于临床、服务于患者。