支气管异物并下呼吸道感染患儿病原菌多重PCR检测结果分析

(1 青岛大学附属医院儿科，山东 青岛 266003； 2 泰山医学院附属医院儿科)

儿童急性下呼吸道感染是儿科患儿常见感染性疾病,占儿科门诊患儿的39.0%～65.5%，占住院患儿的24.5%～65.2%[1]，该病也是发展中国家儿童的主要死亡原因之一[2]。其中病原学是诊断的难点，也是影响患儿治疗以及预后的主要因素，究其原因，一是标本来源困难，二是细菌学检测手段相对落后。近年来，内镜技术在临床上对疾病的诊断与治疗过程中应用越来越广泛，其中下呼吸道感染患儿，利用纤维支气管镜检查，可在镜下直接观察局部病变情况，通过无菌操作采集下呼吸道分泌物进行病原体检测，对下呼吸道感染诊断具有较高诊断的敏感度和特异度[3]。支气管异物是儿科常见的呼吸系统急重症, 外源性物体经口或鼻误吸入气管、支气管内而致病，甚至引发肺部感染[4]。本研究选取支气管异物并下呼吸道感染的78例患儿的下呼吸道分泌物，同时进行分离培养和多重PCR检测，评价患儿致病菌的特点和多重PCR在下呼吸道病原菌感染诊断中的价值。现将结果报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2009年10月—2015年6月于青岛大学附属医院就诊并经纤维支气管镜确诊为支气管异物患儿78例，其中男48例，女30例；年龄11月～11岁。患儿支气管异物滞留时间5～30 d，所有患儿均有发热，57例外周血白细胞升高，31例C-反应蛋白(CRP)升高。所有患儿进行纤维支气管镜检查前均行胸部X线检查或CT扫描，证实或怀疑有支气管异物存在，其中23例有影像学感染证据。纤维支气管镜检查时56例可见黏膜红肿，37例可见肉芽形成，26例可见明显黄白色脓痰，均提示存在下呼吸道感染。

1.2 标本采集与检测方法

所有确诊患儿均于全身麻醉下行纤维支气管镜下支气管异物取出术，术中应用一次性无菌痰杯收集下呼吸道的分泌物标本。标本的分离培养方法：30 min内将标本分别接种到革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌的培养基上，用接种环铺满90 mm平皿，置于35 ℃恒温培育箱18～72 h，每18 h进行一次细菌群体和个体形态特征的观察，72 h后菌种鉴定及药敏试验，严格按照《全国临床检验操作规程》进行。多重PCR检测方法：根据我国社区获得性肺炎常见病原谱[5]确定待检病原菌种(肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌)，参照文献报道的方法进行操作[6-8]。为保证检测结果的准确性，多重PCR检测时DNA提取分装为2管,进行2次检测；并且在进行PCR扩增时设立肺炎链球菌菌种的阳性对照及空白阴性对照。

1.3 统计学分析

采用SPSS 24.0软件进行统计分析，应用校正Personχ2检验对两种方法病原菌检出率进行比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

78例患儿下呼吸道分泌物标本中分离培养检出金黄色葡萄球菌10株，肺炎克雷伯菌6株，成团泛菌3株，病原菌检出率为24.3%。多重PCR检测出流感嗜血杆菌39株，肺炎链球菌24株，金黄色葡萄球菌15株，肺炎克雷伯菌7株，病原菌检出率为96.2%。75例检出细菌的患儿中有3例同时检出3种细菌,2例同时检出2种细菌。应用校正Personχ2检验进行比较，两种方法病原菌检出率比较差异有显著性(χ2=6.218，P<0.05)。

3 讨 论

支气管异物是儿童时期常见急危疾病之一，是导致3岁以下儿童急性死亡的重要原因之一[9]。儿童由于臼齿未萌出、咀嚼功能差、咳反射不健全等原因，极易发生异物吸入。较长时间的异物嵌顿会出现支气管黏膜充血、肉芽组织生成、炎性分泌物增多的症状；另外异物本身不洁以及花生、瓜子等富含不饱和脂肪酸的异物对支气管黏膜造成刺激，极易并发下呼吸道感染[10-12]。本研究中分离培养的病原菌检出率较低，仅为24.4%，其中包括可能污染的成团泛菌，因此需要更为准确的病原学检测方法。

常规细菌分离培养之所以检出率较低，考虑与标本质量、抗生素使用、培养条件、生长周期等因素的影响有关。本研究中收集的支气管异物患儿下呼吸道分泌物标本，较多患儿异物嵌顿时间较长，有肉芽组织生成，钳取异物时易出血，部分标本混有血液，血液中的吞噬细胞可能吞噬细菌。术前给予患儿吸入的局麻药以及润滑纤支镜的润滑剂也易混入标本中，经较长时间作用后，也可能会对培养结果造成一定影响[13]。有研究表明，抗生素可明显降低血液细菌培养的检出率[14-15]，本研究78例患儿仅2例术前未使用抗生素，不合理应用抗生素也是分离培养病原菌检出率低的一个重要原因。

近10余年来，随着分子生物学技术的迅速发展，分子、基因水平诊断致病菌已成为病原学诊断的研究方向和热点。目前常用的分子生物学诊断方法有PCR、限制性内切酶片段长度多态性、单链构象多态性和探针杂交法等。单重PCR一次只能检出一种病原，随着临床上对病原菌混合感染的诊断及鉴别诊断的要求日益急迫,出现了多重PCR检测方法。有研究设计了同时检测痰液、鼻咽抽吸物、肺泡灌洗液中肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体和肺炎衣原体的多重PCR体系,实现了以上四种病原体的同时检测；并以分离培养和咽漱液PCR为金标准，评价该反应体系对待检菌的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值，可以为患者的抗生素治疗提供参考[16-17]。本研究结果显示多重PCR的病原菌检出率明显高于分离培养的病原菌检出率，两者差异有显著性；且75例检出细菌的患儿中有3例同时检出3种细菌,2例同时检出2种细菌，提示多重PCR可检测出混合感染的病原菌。与先前的研究结果一致[18-19]。相较于传统的细菌分离培养方法，多重PCR可在单次反应中同时检测出多种病原菌，有助于细菌混合感染的鉴别诊断；另外传统的细菌分离培养时间需约3～7 d，而多重PCR几小时即可出结果，缩短了检测时间，有助于早期诊断和及时治疗[20]。但多重PCR也存在一定的缺点：如该检测方法以分子生物学基因扩增技术为基础，无法实现药物敏感性试验，而且该反应体系对不同特异性片段的扩增效率会随不同设定条件而改变，另外对试验操作要求也比较严苛[21]。

综上所述，本研究表明支气管异物患儿易合并流感嗜血杆菌及肺炎链球菌感染，在对儿童下呼吸道感染病原菌的诊断中，与细菌分离培养相比，多重PCR更为快速、高效、准确，有助于混合感染的鉴别诊断，为选择合适的抗感染药物提供参考，有效避免抗生素滥用，对早期诊断及治疗具有重要意义。