人IER5基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

熊 强，姜晓燕，丁立新，刘晓丹，周平坤，丁库克，

(1．中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所，北京 100088；2．军事医学科学院军事医学研究院辐射医学研究所，北京市放射生物学重点实验室，北京 100850)

【关键字】IER5；Sf9细胞；杆状病毒表达系统；鉴定

早期快速反应基因5(immediate-early response gene 5，IER5)是早期慢反应基因家族的一员，最早是由Williams等人发现并命名[1]。该基因位于1号染色体长臂2区5带3亚带(1q25.3)，含2 350个核苷酸，无内含子。IER5基因的开放阅读框编码327个氨基酸，和其他早期慢反应基因家族pip92、IER2、ETR101一样，氨基酸末端含丰富的脯氨酸，但与pip92、IER2、ETR101基因不同的是，IER5的转录激活不需要磷酸激酶C诱导[2]。

我们的前期工作发现，辐射能够诱导肿瘤细胞IER5基因表达上调[3]；IER5基因的表达抑制可提高细胞分裂进入G2/M期的比例，促进细胞分裂，提高细胞对辐射的拮抗性，即IER5基因沉默使受辐射的宫颈癌与肝癌细胞发生G2/M期阻滞，参与了细胞周期调控[4]；IER5的表达显著降低HeLa细胞电离辐射诱导DNA双链断裂的修复效果[5]；辐射刺激下IER5抑制了CDC25B基因的表达，参与了对CDC25B基因的调控[6-7]。但我们尚未进行IER5蛋白结构方面的探索。

近年来，昆虫杆状病毒表达系统由于具有安全性好、重组蛋白表达量高、能同时表达多个基因、重组蛋白翻译后加工完整等特点，因而受到广泛应用[8-9]。昆虫杆状病毒表达系统始于20世纪80年代，Smith等[10]人在昆虫细胞中通过以杆状病毒作为载体表达出了具有生物活性的人β干扰素。自此之后，经过研究者们不断地改进优化，昆虫杆状病毒表达载体已经有非常成熟的应用。目前，市面上已经有大量商品化的昆虫表达系统，其中应用较为广泛是BD公司的BaeuloGold表达系统和Thermo公司的Bac-to-Bac表达系统。王浩等[11]比较了这两种表达系统的效果，发现Bac-to-Bac表达系统表达效果更好。

本研究拟通过Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统克隆和表达IER5蛋白，进而为后续蛋白质结晶和分析研究该蛋白的结构，结合其结构知识进一步解释在体内的功能及作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

E.coli DH5α、质粒中小提试剂盒购自北京天根生化科技公司，DH10Bac、草地夜贪蛾卵巢细胞Sf9、pFastBac1载体、Cellfectin转染试剂、sf-900Ⅱ SFM培养基、胎牛血清购自Thermo Fisher公司，杆状病毒穿梭载体bacmid小量抽提试剂盒购自Beyotime公司，限制性内切酶Eco RⅠ、Hin dⅢ、Q5高保真DNA聚合酶、T4 DNA连接酶购自NEB公司，琼脂糖购自BioFrox公司，DNA凝胶回收试剂盒购自北京擎科新业生物公司，IER5单克隆抗体购自Sigma公司，FITC标记的山羊抗兔IgG购自Cell Signaling Technology公司，所有引物均由北京中美泰和生物公司合成。

1.2 引物设计与合成

根据NCBI中IER5基因(Genbank登录号：NC_000001.11，基因ID：51278)序列，利用PrimerPremier5.0软件设计带有His标签引物，同时根据载体多克隆位点信息引入酶切位点(Eco RⅠ和Hin dⅢ)和相应的保护碱基，引物序列为：上游引物5′-CCGGAA TTCGATGcatcatcaccatcaccatGAGTTCAAGCTGGAGGCT C-3′，下游引物 5′-CCCAAGCTTGTCAGAAGGCCAC GATGGCTGTGC-3′，下划线表示酶切位点，小写表示His标签序列。

1.3 IER5基因PCR扩增

以HeLa细胞cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为50μL：5×Q5反应缓冲液10μL，10 mol/L dNTPs 1μL，上下游引物各2.5μL，cDNA模板1 μL，5×Q5 High GC Enhancer 10 μL，Q5超保真DNA聚合酶，双蒸水补至50μL。PCR反应条件：98℃预变性30 s；98℃变性10 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s，共32个循环；72℃延伸2 min；4℃保存。

1.4 重组转移载体p FastBac1-IER5构建及鉴定

用Eco RⅠ和Hin dⅢ酶分别对回收后的IER5基因目的片段和质粒pFastBacTM1双酶切。用T4 DNA连接酶连接双酶切后的目的片段和质粒片段，过夜。将连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃培养过夜。挑取单个阳性克隆菌落，继续培养后用天根质粒中小提试剂盒提取质粒，并用Eco RⅠ和Hin dⅢ酶双酶切鉴定。将双酶切鉴定正确的菌株送公司测序，测序正确的重组载体命名为pFastBac1-IER5。

1.5 重组穿梭载体rBacmid-IER5构建及鉴定

将测序正确的重组转移载体pFastBac1-IER5转化感受态大肠杆菌DH10Bac，涂布于含50μg/mL卡那霉素(kanamycin)，7μg/mL庆大霉素，10μg/mL四环素，100μg/mL卤代吲哚基-β-D-半乳糖苷和40μg/mL异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB琼脂平板，37℃培养48 h。从平板上挑取白色克隆菌落，扩大培养后提取重组质粒。利用PCR技术对重组穿梭质粒进行鉴定，PCR引物为穿梭质粒Bacmid的M13通用上下游引物(M13 正向引物：5′-CCCAGTCACGACGTTGTAAAA CG-3′；M13反向引物：5′-AGCGGATAACAATTTCA CACAGG-3′)。PCR鉴定反应条件为：95℃预变性3 min；95℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸3 min，共32个循环；72℃再延伸7 min。PCR扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定正确的重组杆状病毒穿梭质粒命名为rBacmid-IER5。

1.6 重组杆状病毒的制备

参照Cellfectin Reagent转染试剂说明书，分别取3μg rBacmid-IER5重组质粒和8μL转染试剂于300 μL无血清培养基中室温孵育30 min后，将两溶液混合室温再孵育20 min。转染Sf9细胞后5 h，将培养基换成含10%FBS的培养基继续培养。待细胞出现明显病变时，收集细胞及上清液，500 g离心5 min，去除细胞和大的细胞碎片，收集上清，即为P1重组杆状病毒。将P1代病毒感染Sf9细胞，48 h后，离心收集上清，即P2代重组杆状病毒。

1.7 间接免疫荧光试验鉴定重组杆状病毒

将Sf9昆虫细胞以8×105个/皿的量铺于35 mm细胞培养皿中，以MOI=1接种重组杆状病毒，同时设立不接种病毒的Sf9细胞作为对照。待细胞出现明显病变后，弃去培养基，用PBS清洗3次后，用预冷的甲醇溶液固定细胞30 min。弃固定液，用PBS清洗3遍后用5%的封闭液室温封闭1 h。弃封闭液，用PBS清洗3次后加入1∶400倍稀释的兔源IER5单克隆抗体作为一抗，37℃孵育1 h。用PBS清洗3遍后，避光加入1∶500稀释的FITC标记羊抗兔IgG，37℃孵育1 h。用PBS清洗3遍后荧光显微镜下观察绿色荧光强弱并拍照。

1.8 重组蛋白SDS-PAGE和Western blot鉴定

将P2代病毒感染Sf9细胞，待细胞出现明显病变时，收集细胞及提取蛋白质。SDS-PAGE电泳结束后，用0.01%的考马斯亮蓝染液染色，脱色，成像分析结果。

电泳结束后将样品转印至硝酸纤维素(nitrocellulose)膜。5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，加入1∶1 000稀释的兔源抗IER5一抗，室温放于低速摇床孵育2 h，用PBST清洗3遍。加入1∶2 000羊抗兔的二抗，室温在摇床低速摇晃1 h，用PBST清洗3遍后加入化学发光液显色。

2 结果

2.1 IER5基因扩增

利用HeLa细胞cDNA为模板进行PCR扩增IER5片段，PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定结果如图1所示，得到一条1 000 bp左右(1 022 bp)的条带，与预期条带大小一致。

图1 IER5基因扩增片段

2.2 双酶切鉴定重组转移载体p FastBac1-IER5

将经EcoRⅠ和HindⅢ酶切后的IER5片段和pFastBacTM1质粒用T4DNA链接酶连接，转化至DH5α感受态细胞。扩大培养后提取重组质粒，经EcoRⅠ和HindⅢ酶酶切，再用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。电泳结果如图2所示，在1 000 bp和4 700 bp处有2条与预期大小一样的条带，与预期条带大小一致，表明IER5基因已经成功克隆入pFastBacTM1质粒中，成功构建了重组杆状病毒转移载体pFastBac1-IER5。

图2 双酶切鉴定重组转移载体pFastBac1-IER5

2.3 PCR鉴定重组穿梭质粒rBacmid-IER5

提取质粒后，用穿梭质粒Bacmid上的通用引物M13对重组穿梭质粒进行PCR鉴定。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3，在3 300 bp左右出现1条条带，与预期大小一致，表明成功制备了重组穿梭质粒rBacmid-IER5。

2.4 转染病毒后Sf9细胞形态学变化

Sf9细胞感染重组杆状病毒后，每隔12 h观察一次细胞的形态。如图4B所示，大约到72 h左右，感染重组病毒后的细胞开始出现明显变化，细胞直径慢慢增加，折光性变强，逐渐脱壁直至细胞破碎死亡。但图4A所示的未感染重组病毒的细胞无明显变化。

图3 PCR鉴定重组穿梭质粒rBacmid-IER5

2.5 重组IER5蛋白间接免疫荧光

用P2代重组杆状病毒感染Sf9细胞，待细胞出现明显病变时，用甲醛固定进行间接免疫荧光检测。如图5B所示，在荧光显微镜下可以看到感染重组杆状病毒的细胞出现绿色荧光，而图5A正常细胞未出现荧光，说明重组IER5蛋白在昆虫细胞中成功表达。

2.6 重组IER5蛋白SDS-PAGE和Western blot分析

为了鉴定重组蛋白的相对分子质量和活性，对重组蛋白进行了SDS-PAGE和Western blot检测。SDSPAGE结果见图6，泳道2显示在48 k处出现特异性条带，与预期条带大小一致，而图6泳道3显示野生型杆状病毒感染未出现特性条带。

Western blot结果见图7，泳道1显示在48 k处出现特异性条带，与SDS-PAGE结果一致，表明在Sf9细胞中表达的IER5重组蛋白能与抗体发生特异性反应。

图4 感染病毒后Sf9细胞形态学变化

图5 间接免疫荧光检测IER5重组蛋白的表达

3 讨论

IER5为放疗敏感基因，其过表达能抑制宫颈癌细胞增殖，促进细胞凋亡，表现出辐射增敏作用[12]。IER5蛋白是一种转录因子蛋白，主要存在于细胞核中。研究也发现，在辐射刺激下IER5下调了CDC25B基因的表达，且CDC25B基因是一种非常重要的细胞周期调控蛋白，所以IER5基因也与细胞周期密切相关[4，6-7]；日本的科学家也发现IER5基因的表达受热休克因子1(heat shock factor 1，HSF1)调控的同时，也影响HSF1的去磷酸化，起到正调节的作用[12-15]。除此之外，该基因被发现参与DNA的损伤修复[5]。

图6 SDS-PAGE检测IER5蛋白表达

图7 Western blot检测IER5蛋白表达

杆状病毒载体表达系统是一个以昆虫杆状病毒为外源基因载体，以昆虫和昆虫细胞为受体的真核表达系统[16]。本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达IER5蛋白。首先我们将IER5基因克隆至转移载体pFastBac1质粒中，随后把携带杆状病毒基因组的重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞DH10Bac，筛选转座后的阳性重组穿梭载体rBacmid-IER5，转染Sf9细胞后获得携带IER5基因的重组杆状病毒颗粒，重复感染获得P2代重组杆状病毒，将P2代病毒感染昆虫细胞，收获IER5蛋白。结果表明，IER5蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中获得成功表达。

本课题组前期尝试用大肠杆菌原核系统表达IER5蛋白，但未成功表达。我们分析了IER5的基因序列，发现该基因的密码子适应指数(codon adaptation index，CAI)值为0.62，较低，不符合GenScript’s Optimum GeneTM密码子优化软件所建议的高表达优化CAI 0.8～1.0取值范围[17]，故该基因不适合大肠杆菌原核表达系统表达。随后我们对IER5基因进行密码子优化，仍然未在大肠杆菌中表达成功。我们又利用生物信息学对IER5蛋白质二级结构进行分析，发现该蛋白质的不稳定区较长，表示该蛋白不稳定。酵母表达系统表达外源蛋白水平高，但其表达的蛋白质分泌能力相对较低，且表达的蛋白质糖基化修饰具有局限性[18]，所以我们选择昆虫杆状病毒表达系统对IER5蛋白进行表达。

本研究采用昆虫杆状病毒表达系统对IER5蛋白进行表达，Western blot鉴定和间接免疫荧光结果显示，昆虫细胞中表达的蛋白能够被IER5特异性抗体识别，证明成功表达了重组IER5蛋白，且与预期大小相符，同时也说明该重组蛋白具有良好的反应原性。

本研究采用SDS-PAGE对重组蛋白进行检测，跟野生型杆状病毒感染组相比，出现了特异性条带，但是跟阳性对照组(BSA)相比，目标条带较浅，说明重组蛋白的表达量不高。分析原因，IER5蛋白主要存在细胞核中，可能与蛋白没有胞外表达，以及细胞裂解后部分外源蛋白黏附在细胞碎片上有关[19]。为提高重组蛋白在昆虫细胞中的表达水平，优化后续试验的表达条件，进一步探索蛋白质的三级结构作准备。