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PM 2.5对HBE细胞致癌致突变相关基因表达的影响

2020-02-12王冰玉谢红卫徐新云

癌变·畸变·突变 2020年1期
关键词:基因芯片染毒差异基因

王冰玉 ,蔡 颖 ,郑 凯,谢红卫,徐新云

(1.深圳市疾病预防控制中心环境与健康所,广东 深圳 518055;2.南华大学公共卫生学院,湖南 衡阳 421001)

细颗粒物(fine particulate matte,PM2.5)指空气中空气动力学当量直径≤2.5μm的颗粒物[1-2]。因其易附带有毒、有害物质,且粒径小,活性强,易较长时间悬浮在空气中,对大气环境以及人体健康都产生较大的危害作用,尤其是对呼吸系统的威胁最为严重[3]。已有许多研究表明,PM2.5短期暴露后,可使局部支气管的通气功能下降;长期暴露后,可发生支气管炎、哮喘甚至肺癌[4]。随着工业发展和经济水平快速提高,我国大气中PM2.5浓度的增加,远高于世界卫生组织(World Health Organization,WHO)推荐的空气质量水平[4],导致空气污染加剧,对人类健康造成了极大的威胁,因此,探讨PM2.5的致病机制和预防控制措施十分重要。

基因芯片是20世纪80年代中期提出来的一种基于碱基杂交互补原理进行大量的基因表达及监测等的技术,因其具备高通量、自动化、高效等特点,越来越为广大科研工作者所青睐,为进一步探索疾病的发病机制及其临床诊断和治疗具有重要意义。基因芯片又称DNA集微芯片、DNA微阵列技术,其主要原理是分子生物学中的核酸分子原位杂交技术,通过技术手段将DNA片段固定到介质上,随后将荧光标记样本与其杂交,从而对样本基因进行规模检验[5]。江勇等发现基因本体数据库(Gene Ontology,GO)功能注释和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)功能分析可以发现肝癌潜在的发病机制和核心基因,为肝癌的诊断和治疗提供了依据[6]。储海燕等运用基因芯片技术检测了染毒PM2.5后人支气管上皮细胞全基因组的转录情况,发现表达变化的基因中的一部分也可能导致了心脑血管疾病的发生[7],将A549细胞暴露于PM2.5中已知的有机物成分中,发现A549细胞的基因表达谱发生改变,并且通过GO分析发现这些发生改变的基因主要参与芳烃受体的激活、内源性和外源性物质的代谢,从而影响细胞的炎症反应、氧化应激、癌变及増殖过程[8]。基于上述研究,利用基因芯片技术对PM2.5毒性的研究是非常有意义的,为之后的鉴定和课题深入研究奠定基础。人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells,HBE)是永生化人支气管细胞系,仍保持人支气管上皮细胞及非致瘤性特征,且PM2.5对人群的危害,首先波及上呼吸道,选用HBE细胞作为实验处理对象,可使实验结果更接近人群真实情况。本文采用基因芯片技术,对PM2.5暴露的HBE细胞以及对照组进行差异基因筛选[8],结合生物信息学分析方法,进一步对筛选得到的差异基因进行聚类以及功能富集分析,筛选与PM2.5致癌致突变的核心基因以及构建蛋白质互作网络图,以探讨PM2.5致HBE细胞基因表达水平的改变情况,为进一步研究PM2.5对HBE的毒性作用机制提供重要线索。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

HBE细胞购于中国上海细胞库,PM2.5样品来源山西省太原市,胎牛血清(FBS)、0.25%Trpsin-EDTA购于美国Gibco公司,DMEM培养基购于Hyclone公司,QIAGEN RNeasy®Mini Kit试剂盒购于德国QIAGEN公司,氨基烯丙基扩增试剂盒(Amino Allyl MessageAmp II aRNA Amplification Kit,AM1753)购于美国Ambion公司。

1.2 PM2.5的采集和制备

实验用武汉天虹TH150 F中流量采样器和80 mm直径的石英滤膜,按100 L/min的流量连续采样,每天采样24 h,采样地点在山西省太原市山西大学校园内,采集时间为2018年12月。将吸附有PM2.5颗粒的石英滤膜剪成4小块放入装有超纯水的烧杯中,用锡纸包住口,超声振荡30 min洗脱PM2.5颗粒物,冷却至室温后放入-80℃冰箱。然后将样品洗脱液真空冷冻干燥24 h后紫外线照射1 h,加入无菌水制备成PM2.5样品储备液,高压灭菌后可用于细胞实验,使用前振荡混匀。

1.3 细胞培养与染毒处理

用10%的胎牛血清和DMEM培养基将HBE细胞培养于CO2体积分数为5%、37℃的恒温培养箱中,待细胞铺满培养瓶底面积的70%~80%时,将培养的细胞消化后进行计数,调节悬液浓度,然后以5×105个/mL的浓度接种至6孔板,每孔加2 mL DMEM完全培养基,待细胞铺满瓶底面积的80%左右时进行PM2.5染毒处理,染毒浓度为50μg/mL,染毒时间24 h。

1.4 基因芯片

本研究使用的基因芯片由华大基因生物技术公司提供的人类基因体芯片(human OneArrayTM,HOA),是以UniGene最新数据库为基础,应用IMPORT专利技术进行探针的开发,设计高度专一化的60-mer寡核苷酸探针。每一芯片上布放超过3万个探针,涵盖3万以上个基因及数种实验控制探针。

1.5 方法

1.5.1 样本RNA提取和纯化HBE细胞的总RNA使用QIAGEN RNeasy®Mini Kit试剂盒提取和纯化细胞总RNA,通过NanoDrop ND-1000(Thermo Scientific)进行RNA浓度和纯度的检测,通过安捷伦RNA 6000 nano assay检测RIN值来判断RNA的完整性。

1.5.2 样本制备质控样本制备包含RNA扩增及荧光标记。使用AM1753试剂盒扩增得到氨基-烯丙基反义 RNA(Amino-allyl antisense RNA, aa-aRNA), 与NHS-CyDye(Cy5)反应结合完成荧光标记与纯化后进行芯片杂交。本步骤质控使用NanoDrop ND-1000对完成标记的aa-aRNA定量,Cy5的标记效率需达到每1 000个核苷酸包含15染料分子以上,同时采用D(260)/D(280)鉴定其纯度。

1.5.3 芯片杂交与扫描芯片组合后,配制RNA混合物与变性物,用其将芯片杂交后将芯片清洗。将预热于50℃烘箱中的芯片取出,于芯片第1层切口处加入加热反应完后的RNA mixture(180μL)。完成后套上第2层热缩膜,放入50℃杂交烘箱旋转架上,烘箱转速设定约为2 r/min、反应时间16 h。用预先准备的42℃杂交清洗液I、II及25℃杂交清洗液II将芯片清洗,清洗后将芯片上的水分甩干后将芯片置于黑色芯片盒中,避光等待扫描。使用扫描仪Molecular Devices之AXON4000B扫描芯片。借由适当的荧光强度设定与分辨率(10μm)获得影像(tiff格式)。利用GenePixTM4进行影像数据撷取,获得初级数据格式gpr档案即完成将影像转成数值,进行后续数据分析。

1.6 生物信息分析

1.6.1 芯片数据预处理和基因差异分析基因表达谱检测芯片的数据分析是用 Rosetta Resolver®System(Rosetta Biosoftware)进行数据前处理(含数据筛选、校正)与统计分析。利用基因表达倍数变化值(fold change,FC)筛选差异表达基因,筛选条件满足log2|FC|≥1且P<0.05;比对组别中至少一个样本的探针讯号≥200,缩小FC的范围,进一步分析筛选出前10个上调基因和前10个下调基因。

1.6.2 GO功能注释、通路及生物学功能富集分析使用Cluster Profiler软件对筛选得到的差异基因在GO中注释,并进行通路及生物学功能富集注释分析,以判定差异基因主要影响的生物学功能和通路。P<0.05表示差异有统计学意义。

1.6.3 蛋白质网络结构图分析通过String软件分析差异表达基因的蛋白互作关系,并以此来构建蛋白质相互互作用网络图。将String蛋白质相互作用数据库分析得到的结果导入Cytoscape软件,通过网络分析插件CytoHubba计算节点的边(即互作连线的数量),筛选得到网络中心节点(hub node)。中心节点对应的基因即为核心蛋白。

2 结果

2.1 样品RNA的总量与纯度

本研究收集的样品RNA总量与纯度见表1,可见其符合实验要求。

表1 样品RNA的总量与纯度

2.2 基因的差异表达与聚类分析

根据差异表达筛选条件,在基因芯片实验结果中,PM2.5染毒处理HBE细胞后,共筛选出245个差异表达的基因,见表2。其中上调基因27个,下调基因218个,差异表达基因火山图见图1A。log2|FC|<-1的为下调基因所在范围,log2|FC|>1为上调基因所在范围,进一步缩小筛选范围筛选出排名前10的上调基因和下调基因为核心基因。通过聚类分析可视化重复及样本间的相似性做出热图(图1B)。本分析中以差异表达基因探针在所有芯片间的差异基因,筛选出前250基因探针进入分析。

2.3 差异表达基因的GO功能注释和富集分析

将筛选出的差异表达基因进行GO功能注释和富集分析,结果表明,差异表达基因在分子功能(mlecular function,MF)、生物过程(biologicalprocess,BP)及细胞组成(cellular component,CC)的分布是存在差异的。分析发现差异表达基因主要由细胞膜的固有成分、胞膜、细胞外围等成分组成,富集在跨膜受体活性、受体活性、细胞信号传导、细胞分子传导等分子功能。同时富集于离子跨膜转运、细胞对脂多糖无机离子跨膜转运、细胞营养转运等生物过程,见图2。

表2 PM 2.5染毒后核心基因表达

图1 PM2.5染毒HBE细胞后的基因差异表达火山图和聚类分析热图

2.4 差异表达基因的KEGG富集分析

KEGG富集分析结果显示有7个最显著的富集通路,核心富集通路表见表3,其主要涉及肿瘤细胞迁移、信号传导、胆汁代谢相关、遗传毒性等方面。排名前7的生物途径富集分析见图3,包括富集程度排名第1、与肿瘤细胞生长、肿瘤发生和迁移相关的focal adhesion通路,富集程度排名第2的与胆汁代谢相关的bile secretion通路,与细胞内信号传导相关的ABC transporters通路等。

图2 差异表达基因的GO功能注释和富集分析图

表3 核心富集通路表

图3 排名前7的生物途径富集分析

2.5 蛋白互作用网络分析

图4 蛋白相互作用网络图

使用String蛋白互作数据库分析处理差异基因,构建蛋白互作用网络图(见图4),根据Cytoscape软件筛选节点数最相关的5个核心蛋白,对应的基因分别为生长抑素基因SST、脑源性神经营养因子基因BDNF、神经细胞黏附分子1基因NCAM1、生长抑素受体1基因SSTR1和凋亡基因BCL2类11基因Bcl2L11。

3 讨论

在我国许多城市,大气PM2.5水平严重超岀WHO的标准。PM2.5空气污染持续影响人群的公共健康,在可改变的危险因素中,空气污染位列造成我国疾病负担的第4位[9],中国排名前4位的死因分别是脑卒中(23.92%),肺部疾病(14.28%),冠心病(11.71%)以及肺肿瘤(5.19%),这4种疾病均与PM2.5相关。而本文应用基因芯片检测PM2.5对HBE细胞基因表达谱的影响,从而为探究PM2.5致癌机制提供科学依据。

本研究用PM2.5急性染毒HBE细胞24 h,应用生物信息学技术深入分析其基因芯片的结果。根据筛选条件结果显示上调基因27个,下调基因218个。这些结果提示PM2.5影响HBE细胞的基因转录过程。通过对差异基因的GO功能注解聚集分析和KEGG生物途径富集分析,结果显示差异基因表达主要富集于细胞分子传导等分子功能,发现差异表达基因主要富集在跨膜受体活性、细胞信号传导等分子功能。同时富集于离子跨膜转运、细胞营养转运等生物过程。KEGG富集分析显示,HBE细胞中差异表达的基因涉及通路有与肿瘤细胞迁移相关的黏着力,与胆汁代谢相关的胆汁分泌,与神经毒性、遗传毒性相关的神经活性配体-受体相互作用,参与细胞分化、免疫、凋亡的信号通路JAK-ATAT,这些为PM2.5致细胞凋亡和致癌作用机制提供了参考。

抑癌基因的正常功能是抑制细胞的生长,其表达下调导致功能的缺失有助于肿瘤的发生,WAP-4-二硫核结构域蛋白(WAP four-disulfide core domain 1,WFDC1)基因定位于人染色体16q24.1上,最初被认为是一种抑癌基因[10],有研究表明,在肺、肝、膀胱和卵巢肿瘤中可以观察到WFDC1基因的表达下调[11-13],本文筛选出明显差异低表达的WFDC1基因,可推测PM2.5染毒使抑癌基因WFDC1的表达异常下调,从而使其功能的缺失。Wnt信号通路与细胞的发育分化密切相关,对正常和肿瘤细胞生长都至关重要,因其启动蛋白为Wnt蛋白而得名[14]。研究表明SFRPs是分泌型蛋白,能结合Wnt,干涉Wnt信号通路传导,其或与受体竞争结合Wnt蛋白,或直接与Wnt蛋白结合,阻断Wnt信号通路的转导[15],本实验结果显示分泌型卷曲相关蛋白(secreted frizzled related protein 1,SFRP1)基因的差异高表达,提示PM2.5染毒HBE细胞后Wnt通路被激活,从而导致Wnt通路拮抗剂基因SFRP1的高表达。此外,本次研究发现,PM2.5处理后,排名前10的表达上调的基因中,磷酸酶肌动蛋白调节因子1(phosphatase and actin regulator 1,PHACTR1)基因是排位第1,上调最明显的基因;有研究表明此基因与小鼠急性肺损伤有关[16],且此基因是肺癌DNA修复能力的决定性因素之一[17],PHACTR1基因的高表达提示,PM2.5对HBE细胞的DNA损伤有一定影响,DNA损伤通常被认为是引起细胞癌变或突变的重要原因。本课题组计划在接下来的实验中,将重点针对与致癌相关的WFDC1、SFRP1基因,与DNA损伤相关的PHACTR1基因,进一步验证这些基因与PM2.5致癌致突变作用的分子机制。

综上所述,PM2.5染毒HBE细胞后,其基因表达谱发生多方面的变化,涉及许多生物过程和通路的改变。本课题重点关注PM2.5致癌致突变作用,本文筛选出来的与PM2.5致癌致突变的差异基因及其相关蛋白和通路,为进一步深入研究PM2.5毒性作用机制提供了非常有价值的信息和新的研究方向。

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