芒果苷对HepG2 细胞胰岛素抵抗的影响

何乐毅凡，徐暾海*，王 扬，李龙宇，伍一炜，刘铜华

（1.北京中医药大学中药学院，北京 100029；2.北京中医药大学中医养生学北京市重点实验室，北京 100029；3.北京中医药大学中医养生学教育部重点实验室，北京 100029）

芒果苷主要存在于漆树科植物芒果的果实、叶、树皮或百合科植物知母的根茎、地上部分或鸢尾科植物射干的 花、叶等植物中[1-2]。现有文献报道证明其具有多种药理学活性，包括抗肿瘤[3-4]、保护心血管[5]、调节脂代谢异常[6]、抗糖尿病及其并发症[7]等广泛的药理作用。本实验采用HepG2 细胞研究芒果苷体外降糖效果及对p-AKT（Thr308）、p-GSK-3β（Ser9）、AMPKα 及GLUT2 蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验细胞 HepG2 人肝癌细胞系来自北京中医药大学基础医学院保存细胞株。

1.2 实验药物 芒果苷来自北京中医药大学中医养生实验室保存单体

1.3 试剂和仪器 DMEM 高糖培养基（美国Gibco 公司）；青霉素-链霉素混合液（biotopped）；胎牛血清（美国O－RIGIN 公司）；磷酸盐缓冲液（biotopped）；胰岛素（诺和灵R）；盐酸二甲双胍（中美上海施贵宝制药有限公司）；胰蛋白酶-EDTA 溶液（biotopped）；葡萄糖检测试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）；cck-8（日本同仁化学研究所）；细胞培养瓶（Fisher scientific 公司）；96 孔板（美国Corning 公司）；细胞培养皿（美国Corning 公司）；6 孔板（美国Corning公司）；全蛋白提取试剂盒（江苏凯基生物有限公司）；BCA 蛋白定量试剂盒（康为世纪生物科技有限公司）；抗体p-AKT（Thr308）、p-GSK-3β（Ser9）、AKT、AMPKα、GSK-3β、GLUT2、β-actin（美国CellSignaling Technology 公司）；Blocking one（日本 NacalaiTesque 公司）；Solution1（日本TOYOBO 公司）；Solution2（日本TOYOBO 公司）；10×TBST 封闭洗涤缓冲溶液（北京普利莱基因技术有限公司）；10×TBS 封闭洗涤缓冲溶液（北京普利莱基因技术有限公司）；分离胶缓冲液（北京普利莱基因技术有限公司）；浓缩胶缓冲液（北京普利莱基因技术有限公司）；30%蛋白凝胶溶液（北京拜尔迪技术有限公司）；超纯水实验室自制美国Millipore。R200D 型分析天平（德国赛多利斯集团）；HERA cell 150i CO2孵育箱（美国Thermo scientific公司）；HDL 型超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；IX71 倒置显微镜（日本Olympus 公司）；Glomaxmulti 酶标仪（美国promega 公司）；Sigma 台式高速低温冷冻离心机（Sigma-Aldrich 公司）；恒温培养震荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）。

1.4 HepG2 细胞实验操作流程

1.4.1 HepG2 细胞的培养 HepG2 细胞培养于含10%灭活胎牛血清的4.5 g/L DMEM 高糖培养液中，于37 ℃、5.0% CO2细胞培养箱中培养24 h 后观察细胞生长状态，覆盖95%及以上瓶壁后，用胰蛋白酶消化，按照1:3 的比例待传代2～3 次后，可用于实验操作。

1.4.2 芒果苷对HepG2 细胞活性的影响 实验设为正常组、对照组、实验组、空白对照组，其中正常组为含细胞和完全培养基，对照组加入含DMSO 溶液（500 μg/mL）培养基，实验组加入不同浓度的含芒果 苷（500、250、125、62.5、31.25、15.625 μg/mL）培养基，空白组为不含细胞和任何药物的培养基。待90%HepG2 细胞贴壁生长后，按照不同处理方法作用细胞24 h 后，加入CCK-8 溶液将培养板放在37 ℃恒温培养箱内孵育2 h，用酶标仪分别于30、60、120、180 min 测定450 nm 处的吸光度值，按公式计算细胞存活率。细胞存活率=（实验组/对照组－空白对照组）/（正常组－空白对照组）×100%。

1.4.3 芒果苷对胰岛素抵抗HepG2 细胞葡萄糖消耗的影响 实验设为实验组、阳性对照组、模型组、正常组，实验组含不同浓度的芒果苷（60、30、15 μg/mL），阳性对照组含200 μg/mL 二甲双胍溶液。待80%HepG2细胞贴壁后，实验组、阳性对照组、模型组加入含1×10-6mol/L 胰岛素溶液的培养基，正常组加入不含胰岛素溶液的培养基，造模36 h 后，对细胞进行12 h的饥饿处理，按照不同处理方法作用细胞培养24 h 后，饥饿细胞8 h，每孔吸出2 μL 培养基上清液加到新的96 孔细胞培养板中，另加入2 μL 标准对照品，再加入葡萄糖测试工作液（R1、R2 等量）于37 ℃、5.0%CO2培养箱中培养15 min，置于酶标仪560 nm 下检测96 孔板中上清液中的葡萄糖含量。为消除细胞个数对葡萄糖消耗量的影响，每孔加入10 μLCCK-8，在37 ℃恒温培养箱内孵育2 h，用酶标仪分别于30、60、120、180 min 测定450 nm 处的吸光度值，在按照公式计算细胞葡萄糖消耗率。细胞葡萄糖消耗量=（总葡萄糖含量－剩余葡萄糖的含量）/（实验组/阳性对照组－空白对照组）。

1.4.4 芒果苷对HepG2 细胞胰岛素信号传导通路的相关蛋白表达的影响 实验设为正常组、模型组、实验组（60、15 μg/mL），每组3 个复孔。细胞造模36 h后分组给药12 h 后，用全蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白量，加2×蛋白上样缓冲液和PBS 调整每组蛋白为统一值，100 ℃煮沸5 min 后置于-20 ℃冰箱中保存备用。

根据蛋白大小配置适宜浓度的凝胶，每孔18 µg上样量，先90 V 定压预电泳10 min，再100 V 定压电泳90 min。采用湿法凝胶转膜60 或90 min，1×TBS室温摇床中清洗膜1 次10 min；Blocking one 封闭15～30 min 后。孵育一抗体（1:1 000 稀释），于4℃孵育过夜。第二天回收一抗，1×TBST 室温摇床中清洗膜3 次后，加二抗（1:4000）室温孵育1～2 h，回收二抗后以1×TBST 室温清洗3 次，再以1×TBS 清洗2 次，加适量ECL 发光液，避光反应2 min，置于紫外显影仪中对目的蛋白进行成像。用Image J 软件进行蛋白灰度分析。

1.5 统计学方法 数据处理采用SAS 8.2 软件进行分析，实验数据以（）表示。多组比较采用单因素方差分析，2 组间比较采用t 检验；P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 芒果苷对HepG2 细胞活性的影响 与正常组比较，对照组浓度为500 μg/mL 的DMSO 对细胞活性无影响，因此可用DMSO 溶解芒果苷进行实验；与正常组比较，当芒果苷浓度在大于62.5 μg/mL 后对HepG2细胞生长有抑制作用，因此浓度为62.5 μg/mL 及以下的芒果苷均可用于实验，但由于芒果苷为单体化合物，最终选择浓度为60、15 μg/mL 进行葡萄糖消耗实验，见表1。

表1 芒果苷对HepG2 细胞活性的影响（，n=6） %

表1 芒果苷对HepG2 细胞活性的影响（，n=6） %

2.2 芒苷对胰岛素抵抗HepG2 细胞葡萄糖消耗的影响 与正常组比较模型组葡萄糖消耗量明显减少，且存在极显著性差异（P＜0.01），因此胰岛素模型造模成功；与模型组比较，阳性对照组及实验组葡萄糖消耗量均明显增加，虽然实验组葡萄糖消耗量不及阳性对照组，但高剂量组葡萄糖消耗量具有极显著差异（P＜0.01），低剂量组葡萄糖消耗量具有显著差异（P＜0.05），见表2。

表2 芒苷对胰岛素抵抗HepG2 细胞葡萄糖消耗的影响（，n=6）

表2 芒苷对胰岛素抵抗HepG2 细胞葡萄糖消耗的影响（，n=6）

注：与正常组比较，## P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

2.3 芒果苷对HepG2 细胞胰岛素信号传导通路的相关蛋白表达的影响 由表3 及图1 所示，与正常组比较，模型组p-AKT（Thr308）、p-GSK-3β（Ser9）、AMPKα、GLUT2 蛋白表达明显降低且存在显著性差异（P＜0.05），因此胰岛素抵抗模型造模成功；与模型组比较，实验组蛋白表达均明显增加，且高剂量组均存在显著性差异（P＜0.01，P＜0.05），低剂量组除GLUT2 蛋白表达具有显著性差异（P＜0.05），其他蛋白虽有增加但无统计学意义，见表3。

表3 芒果苷对IR-HepG2 细胞蛋白表达的影响（，n=3）

表3 芒果苷对IR-HepG2 细胞蛋白表达的影响（，n=3）

注：与正常组比较，# P＜0.05，## P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

图1 芒果苷对IR-HepG2 细胞蛋白表达的影响

3 讨论

胰岛素抵抗是指各种原因（如炎症、肥胖）使组织对胰岛素敏感性下降，使肝脏、肌肉、脂肪组织等靶细胞对葡萄糖摄取和利用的效率下降，其贯穿于 2型糖尿病整个发病过程[7-8]，目前改善胰岛素抵抗成为治疗2 型糖尿病的关键途径之一[9]。肝脏在胰岛素抵抗发生中起到了重要作用，通过参与肝糖原合成与分解、糖异生等过程调节机体的糖代谢过程[10]；芒果苷是一种C-葡萄糖苷的多酚化合物。实验结果表明芒果苷具有改善胰岛素抵抗细胞葡萄糖消耗量的作用；且给予芒果苷刺激8或12 h后，胰岛素抵抗细胞的p-AKT（Thr308）、p-GSK-3β（Ser 9）、AMPKα 及GLUT2蛋白表达显著增加，明显改善细胞胰岛素抵抗，推测其可能是通过改善p-AKT（Thr308）、p-GSK-3β（Ser9）、AMPKα、GLUT2 等与PI3K/Akt 通路有关的蛋白表达水平以发挥降低血糖作用，达到改善胰岛素抵抗作用以缓解2 型糖尿病症状。

本实验从蛋白表达水平探讨芒果苷发挥降糖作用的可能机制，首次推测其可能与PI3K/Akt 信号传导通路有关，但验证的关键性蛋白还有欠缺，并且也仅从蛋白水平单方面推测，因此后续还需增加PI3K/Akt 信号传导通路关键蛋白的验证并进行更深入的多方面、多通路、多途径的验证，以探讨芒果苷发挥降糖作用的可能机制。