膝康止痛方对大鼠膝骨关节炎镇痛作用研究

姚 旭，王清华，王 野

（辽宁中医药大学附属医院，沈阳 110847）

膝关节骨性关节炎（knee osteoarthritis,KOA），是一种以进行性关节软骨退化，软骨下骨改变，关节边缘骨赘形成，滑膜组织炎症和增生，韧带退变和半月板以及关节囊肥大为病理特征的膝关节疾病，是常见的骨关节炎，是骨科康复的常见病[1-5]。膝关节骨性关节炎由力学和生物学因素引发的关节软骨组织异常，以退行性关节病变为主[6]。其主要症状是膝关节疼痛，僵硬，可伴有肿胀，关节活动欠利等。本研究是将我科自制经验方膝康止痛方进行初步的实验研究，通过观察实验结果，为进一步临床研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验用药 膝康止痛方方药组成：独活10 g，羌活10 g，桑寄生15 g，牛膝15 g，海风藤10 g，鸡血藤15 g，川芎6 g，延胡索10 g，甘草5 g。临床服用一天半剂量，折合成大鼠等效剂量为6.6 g·kg-1·d-1，小鼠的等效剂量约为10 g·kg-1·d-1。实验用药制备：全部药品购买于辽宁省中医院大药房。称取药物后，按重量：体积为1:8 的比例加水，煮沸后煎煮2 h，倒出药液后，再重新加水煮沸后煎煮2 h，将2 次的药液混匀后浓缩成终浓度为1.5 g·L-1的储备液冷藏备用。

1.2 主要试剂 IL-1β ELISA 试剂盒，上海酶联生物科技有限提供；TNF-α ELISA 试剂盒，上海酶联生物科技有限提供；Masson 染色试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；醋酸：国药集团化学试剂有限公司生产（分析纯）批号：F20061101。

1.3 主要仪器 RM-2245 石蜡切片机（LEICA），ZKMIAX 显微镜（Olympus），Epoch 酶标仪（BioTek），冷CCD 凝胶成像系统（Image Quant 350），CMIAS 病理显微镜分析处理系统，eppendorf 微量移液器，1 mL和5 mL 医用注射器等。

1.4 动物 wistar 大鼠，SPF 级，雄性，180～220 g；KM小鼠，SPF 级，18～22 g，雌雄各半，购于辽宁长生生物科技有限公司，辽宁省实验动物质量合格证书：SCXK（辽）2015-0001。

1.5 方法

1.5.1 小鼠镇痛实验 小鼠正常适应性饲养3 d，按体质量随机分为4 组。CMC 对照组：给予CMC 混悬液，阿司匹林对照组：阿司匹林，0.2 g·kg-1·d-1，膝康止痛方低剂量组：10 g·kg-1·d-1，膝康止痛方高剂量组：30 g·kg-1·d-1，12 只/组，雌雄各半。按上述各组药物及剂量分别灌胃给药连续3 d，2 次/d。第4 日给药1 次30 min 后，各组小鼠腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 mL/只。分别观察记录各组小鼠：1）扭体反应出现的时间；2）给予醋酸后20 min 内扭体反应发生次数及抑制率。

1.5.2 大鼠膝关节炎实验 大鼠适应性饲养7 d后，按体质量随机分组。1）正常对照组：蒸馏水1 mL·100 g-1·d-1；2）模型组：1 mL·100 g-1·d-1；膝康止痛方低剂量组：6.6 g·kg-1·d-1，膝康止痛方高剂量组：20 g·kg-1·d-1。造模方法：仰卧位固定于木板上，剪去所要注射的膝关节腔周边1 cm 区域的腿毛，络合碘消毒。右膝髌旁内侧切口，逐层打开关节腔，将髌骨向外侧推使之脱位，膝关节处于最大屈曲状态，暴露关节腔，剪断前交叉韧带。正常对照组打开关节腔后不剪断前交叉韧带。各治疗组连续给予上述药物8周，灌胃给药，2 次/d，1 mL·100 g-1·d-1。实验结束后，全部动物麻醉后进行腹主动脉采血，离心后保留血清，存于-80℃冰箱中保存。病理学检测，标本切取后立即投入10%甲醛固定48 h，后入10%甲酸溶液浸泡，连续脱钙12 d，至组织完全脱钙。蒸馏水浸泡，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片6 μm，保存备用。

1.5.3 病理染色方法 HE 染色：Bounin 固定液固定48 h，经30%甲酸脱钙 48 h 后，切片经过二甲苯梯度脱蜡，苏木精浸染5 min，水洗，再入伊红浸染5 min，水洗，二甲苯透明，中性树胶封固。Masson 染色：全部标本按常规石蜡切片程序处理，7 um 厚度切片，切片移至水洗，入 PH6.0 的醋酸-醋酸钠缓冲液浸渍 30 min（37℃），移入浓度为 0.5%的透明质酸酶消化 6 h，经水洗后，切片入 2 mol/L 氯化钙液浸洗 48 h 再经水洗后做Masson 染色，Weigert 苏木素A 和Weigert 苏木素B 等比混合，染色10 min，蒸馏水洗1 min，Masson 复合染色液染色15 min，蒸馏水稍冲洗，1% 磷钼酸液处理5 min，苯胺蓝染色液复染5 min，1% 冰醋酸水处理1 min，脱水透明封片。

1.5.4 甲苯胺蓝染色：甲苯胺蓝染液30 min，自来水冲洗，冰醋酸分化至胞核清晰，再次自来水冲洗，风干后二甲苯透明，中性树胶封固。病理显微镜拍照，每张切片选取3 个不同视野进行拍照。

2 结果

2.1 膝康止痛方小鼠镇痛实验结果 膝康止痛方通过预防性灌胃给药3 天后，0.6%醋酸溶液复制小鼠疼痛模型，观察膝康止痛方对小鼠的镇痛作用。结果发现，溶媒对照CMC 组小鼠20 min 出现明显的扭体反应，膝康止痛方两个剂量组的扭体次数明显减少，与CMC组比较，P＜0.05，具有统计学意义，见表1。

表1 小鼠镇痛试验（扭体法）扭体次数（，n=12）

表1 小鼠镇痛试验（扭体法）扭体次数（，n=12）

注：与CMC 组比较，## P＜0.01

2.2 膝康止痛方治疗大鼠膝关节炎的实验研究结果

2.2.1 大体病理观察 末次给药后24 h，实验动物全部麻醉处死，分离膝关节，暴露关节面，光镜下观察膝关节表面完整度和损坏程度。结果显示，正常对照组大鼠的膝关节关节面光整，色泽如常，未见明显的损伤；模型组出现关节面粗糙，缺损或溃疡形成，且色泽灰暗，有的甚至出现关节软骨的剥脱；中药治疗组损伤均有所缓解。

2.2.2 组织病理学观察结果 大鼠膝关节经过脱钙，切片等过程后，采用了HE，masson 和甲苯胺蓝染色观察关节的损伤情况。结果发现，正常组大鼠的软骨表面光滑完整，结构清晰，软骨细胞排列，染色均匀，可见完整的潮线存在，未见病理系损伤（见图1A）。模型组关节软骨表面出现严重损伤，结构不完整，出现缺损或缺失，软骨明显变薄，结构不清，染色不均，软骨细胞排列紊乱，总数减少，潮线扭曲不规则（见图1B）。膝康止痛方给药组软骨的损伤得到不同程度的缓解，高剂量组效果更好（见图1C，图1D）。

2.2.3 Masson染色结果 正常组胶原纤维和软骨呈蓝色，胞浆纤维素呈红色，胞核呈黑蓝色，四层结构很清晰可以分辨，可以分清潮线；软骨细胞染色均匀（图2A），模型组软骨组织表明受损，形状不规则、缺陷，蓝色的软骨胶原减少，红色的纤维成分增多，分布不均（见图2B）治疗组可逆转软骨细胞的损伤（见图2C，图2D）。

2.2.4 甲苯胺蓝染色 软骨、成骨细胞染色成紫蓝色。正常对照组软骨细胞和成骨细胞染成蓝色，其他染成红色。模型组软骨结构损伤严重，细胞数量明显减少。治疗组损伤均有不同程度的缓解。

图1 关节软骨的HE 染色结果（HE，×100）

图2 关节软骨的Masson 染色结果（Masson，×100）

图3 关节软骨的甲苯胺蓝染色结果（甲苯胺蓝，×100）

2.2.5 病理积分统计结果 参考Markin[7]骨关节病组织评分方法，通过不同的染色方法进行病理评分。结果显示，与对照组相比，模型组大鼠的软骨组织表现出明显的病理学损伤，病理学积分值均显著增高；与模型组相比，中药治疗组的病理损伤均有明显改善，病理学积分值均明显降低。见图4。

2.3 大鼠血清IL-1β、TNF-α 含量检测 实验结束后，将大鼠麻醉后进行腹主动脉采血，取血清后，检测IL-1β、TNF-α 含量。结果发现，与正常组相比，模型组的IL-1β 和TNF-α 均明显增高，P＜0.01；与模型组相比，膝康止痛方组的IL-1β和TNF-α明显降低，P＜0.05和P＜0.01，见表2。

图4 关节炎的病理积分结果

表2 膝康止痛方对关节炎大鼠血清中IL-1β 和TNF-含量的影响（，n=8）

表2 膝康止痛方对关节炎大鼠血清中IL-1β 和TNF-含量的影响（，n=8）

注：与对照组比较，## P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

3 讨论

膝骨性关节炎，中医大致属于“骨痹”“痹证”“膝痹”等范畴[8-9]。病因病机多因肝肾亏虚，劳伤日久，气血不足，筋骨失养，风寒湿邪趁虚而入，气血凝滞，经脉不通，不通则痛，发为本病。肝肾亏虚，是多种疾病发病的基本病机，补益肝肾，是治疗相关疾病的基本法则[10]。本病可从本虚标实的角度辨证施治。本实验用药膝康止痛方是由独活寄生汤、蠲痹汤和我院止痛散加减化裁而成，方中独活、羌活、海风藤以祛风除湿，通络止痛，主祛筋骨间的风寒湿邪。桑寄生、牛膝、补骨脂，补肝肾，壮筋骨，鸡血藤、当归补血舒筋，通络止痛，川芎、延胡索行气通络止痛，甘草益气调和。方中阴阳气血调和，通脉止痛并重。诸药共行补肾强筋，祛风除湿，化瘀止痛之用。

膝关节炎的发病与年龄，体质量指数和身体健康状况关系密切。早期疼痛和晚期的致畸是影响患者生活质量的重要因素[11]。对于膝骨关节炎的治疗，缓解骨关节炎患者的关节疼痛仍然是治疗的焦点。目前临床上用药应用的止痛药物主要为非甾体类抗炎药等[12]，但是疗效的同时产生诸多不良反应。近年来研究发现一些新的潜在治疗关节炎的药物，但还未在临床应用[13]。

中医药治疗膝骨关节炎可通过多种途径缓解疼痛症状，延缓KOA 的病理进程[14-16]。膝康止痛方为我科的经验方剂，经过多年对KOA 患者应用，能明显缓解疼痛症状，提高生活质量，但其机制不清。为了观察膝康止痛方的镇痛作用，我们采用0.6%醋酸小鼠腹腔注射方法复制经典的疼痛模型观察膝康止痛方镇痛作用，从客观的量化角度评价该方的镇痛效果。指标实验结果证明，膝康止痛方能显著抑制醋酸所致的小鼠扭体反应，提示其具有显著的镇痛作用。

炎性细胞因子在膝关节炎的发病过程中的作用日益受到人们的关注。TNF-α 和IL-1β 等细胞因子能够抑制软骨细胞的合成，促进其分解。炎症发生时TNF-α和IL-1β 受到NF-κB 和急性反应蛋白（AP）的调节，以自分泌的方式参与炎症反应，并能促进其他细胞因子如NO，PGE2，IL-6，MMP1，MMP9 和MMP13 的合成与分泌[17-18]。

巨噬细胞存在于正常膝关节，非病理状态下处于休眠状态。但是炎症存在时被激活，分泌的多种致炎细胞因子。其中TNF-α 作用最强，亦能协同其他细胞介素（如IL-1β、IL-6 等）作用，在膝骨关节炎的发生与发展中起到十分重要作用[19]。IL-1β 存在膝骨关节炎中主要IL-1 亚型，有多种细胞（如巨噬细胞，软骨细胞、滑膜细胞等）分泌，与软骨细胞上的受体结合后，一方面促进细胞的凋亡，另外促进基质金属蛋白酶类（MMPs）的合成与分泌，增加软骨细胞的降解，提高破骨细胞的活性，加重膝关节的炎症反应[20］。中药复方以其多药味组合为特点，可以降低炎症细胞因子[21]。

本研究发现在膝关节炎模型大鼠血清中的TNF-α和IL-1β 含量明显增多，灌胃膝康止痛方后显著降低大鼠血清中二者的含量，高剂量组作用更明显。

综上所述膝康止痛方具有明显的止痛作用，能缓解膝骨关节炎的病理进程，且该作用与降低TNF-α 和IL-1β 有关。