NF-κB信号通路对食管癌根治术后吻合口狭窄的影响

张 岩 ，班允泽，蔡宏飞*

(1.吉林大学第一医院 胸外科,吉林 长春130021;2.梅河口市中心医院 骨科，吉林 梅河口135000)

近50年来，食管癌发病率有了明显的增长，食管鳞状细胞癌是我国最常见的食管癌类型。目前，食管癌的首选治疗方法是手术完全切除病变和局部淋巴结。然而，手术治疗方法具有并发症较高的缺点[1,2]，其中吻合口狭窄是食管切除术的主要并发症之一[3,4]。大多数良性狭窄发生在术后前几个月内，吞咽困难往往是出现狭窄的第一症状，给患者带来极大的痛苦[5]。尽管随着手术技术的发展，吻合口狭窄的发生率有所下降，但仍有20%-30%患者存在这一情况，其发生率远远高于预期，且一旦吻合口狭窄发生，没有非常有效的治疗手段。扩张和药物治疗是最常见的干预措施，但复发率仍然很高[1,2]。显然了解吻合口狭窄的机制对于食管癌外科治疗是非常重要的，但目前关于其机制的研究和报道较少。

NF-κB是一种转录因子，由Sen和Baltimore于1986年首次提出。NF-κB的激活与各种疾病的发病机制有关[6,7]，尤其与肿瘤的发展和进展有关。NF-κB的信号通路具有抗凋亡作用，可被炎症、自身免疫性疾病、感染和癌症激活[8]。当患者接受食管切除术时，吻合口会暴露于酸、炎症等因素，这些因素会激活NF-κB信号通路。梅萨迪的论文报道了瘢痕成纤维细胞中活化的NF-κB的表达水平明显高于健康皮肤[9]。

然而目前很少有文献研究NF-κB表达对食管癌根治术后吻合口狭窄的影响。因此，本研究旨在探讨NF-κB信号通路的表达与吻合口狭窄的关系，尤其是p65、bcl-2和ciap-1与吻合口狭窄的关系，为食管吻合口狭窄的治疗提供依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象基本资料

本研究经吉林大学第一医院伦理委员会机构审查委员会批准。收集2014年9月至2015年12月，于吉林大学第一医院行Ivor-Lewis食管切除术的82例食管鳞癌患者(男78例，女4例)入选本研究，患者均为在我院进行了首次手术治疗，未出现吻合口渗漏，且无明显并发症者。术后未接受放疗。研究对象平均年龄为59.3±6.7岁。其中，中段食管癌51例，下段食管癌31例，复发性良性吻合口狭窄32例。吞咽困难的严重程度根据斯图勒评分系统进行评估。一级被定义为参与者可以吃软食品；二级被定义为参与者可以吃半流质食品；三级被定义为参与者可以吃流质食品；四级被定义为参与者不能自己进食。其中，2级狭窄有17例(中食道13例，下食道4例)，3级狭窄对象12例(中食道9例，下食道3例)，4级3例(均为中食道)。所有患者均通过内窥镜检查诊断。同时，50例食管切除术后无吞咽困难的患者纳入对照组。

1.2 组织样本

本研究所有研究对象均签署知情同意书。术前对患者进行胃镜检查，检查其黏膜组织是否正常。手术后，若患者出现吞咽困难，我们首先进行胃涂片食管造影诊断吻合口狭窄，然后胃镜检查以确定诊断，然后用活检钳采集吻合口狭窄区和吻合口旁的组织样本，大小约为1 cm。在用40 g/L中性福尔马林固定所有样品后，将样品脱水并嵌入石蜡中。同时，将每个样品的一部分快速冷冻并储存在液氮中，用于随后的定量RT-PCR分析。

1.3 免疫组化(IHC)

1.4 蛋白质印迹分析(western blot)

p56、bcl-2和ciap-1抗体购自abcam公司(Cambridge,Massachusetts)。将重量为200 mg的样品切成小块，用1 ml的利帕溶解缓冲液(Roche Applied Science)和10 μl的PMSF(Roche Applied Science)缓冲液溶解，用BCA试剂盒(Beyotime，Shanghai，China)测定蛋白质浓度，采用SDS-PAGE法分离等量的总蛋白。用5%脱脂牛奶阻断后，添加一级抗体并在4℃下培养过夜。24 h后将蛋白转移到滤纸膜上，后加入兔抗人抗体p56、bcl-2和ciap-1。将滤纸膜置于封闭4℃缓冲液(0.1 ml/cm2)，于振动筛上培养。然后，加入在封闭缓冲液中稀释的HRP结合二级抗体，并在室温下与细胞膜一起孵育1-2小时后，用PBST冲洗膜4次，每次持续5 min。

1.5 RT-PCR法提取和扩增RNA

本研究使用三唑试剂从组织中分离出RNA。通过检查260/280 nm的吸光度来检测RNA的质量，核酸纯度合格标准：比率在1.8-2.1范围之内。采用M-MLV逆转录酶(日本Takara)将0.5 μg总RNA扩增至最终cDNA(42℃)，持续50 min。将PCR循环设定为：95℃，持续3 min，然后在以下条件下设定35个循环：50 s，94℃；30 s，55℃；60 s，72℃。之后将最终混合物在72℃下培养3 min。质粒的合成和纯化采用Takara(中国大连)。最后计算了uvpro彩色图像分析系统的密度比。

bcl-2(F,5′-GGATCCAGGATAACGGAGGC-3′;R,5′-GGGCCAAACTGAGCAGAGTC-3′),cIAP-1(F,5′-GGCCGTATCTCCTTGTCGG-3′;R,5′-TGCAGGGGGACAAAATAGGG-3′),p56(F,5′-AACTAAGAGCACTGGGAGGCAT-3′;R,5′-GTGCAAGAGCATCATCCAGTT-3′).

1.6 统计分析

利用SPSS 17.0软件对所有数据进行了分析，数据用均数±标准差表示，采用t检验、Wilcoxon双样本检验进行统计学比较。P<0.05被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1患者基本信息如表1所示，有32例患者出现食管狭窄，50例无狭窄对照。就两组患者的一般特征：年龄、性别和癌症部位差异均无统计学意义(P>0.05)。17例为吞咽困难2级，12例分为吞咽困难3级。3例吞咽困难4级。食管吻合口狭窄多发于病理三期。

2.2 IHC检测p56、bcl-2和ciap-1蛋白水平

免疫组化检测组织中p56、bcl-2和ciap-1蛋白表达。p56、bcl-2和ciap-1蛋白在吻合口旁组织中表达较低(如图1所示)，而在食管狭窄组织中p56、bcl-2和ciap-1蛋白水平显著升高(P<0.05)。这些蛋白质大部分位于细胞的细胞质中，细胞中p56、bcl-2和ciap-1的阳性表达标记为棕黄色颗粒，如表2所示。

表1 本研究患者一般情况

2.3 吻合口组织和吻合口旁P56,bcl-2和 cIAP-1的mRNA表达水平

我们通过RT-PCR进一步评估p56、bcl-2和ciap-1的mRNA表达水平。结果表明，与吻合旁组织相比，狭窄组织中p56、bcl-2和ciap-1的mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。同时，3级吞咽困难患者组织的mRNA水平明显高于1级和2级吞咽困难样本(P<0.05)。同时，狭窄患者正常食管上皮细胞中p56、bcl-2和ciap-1的mRNA水平较无狭窄患者明显升高。

2.4 Western blot对P56,bcl-2,and cIAP-1蛋白表达的测定

Western blot对P56,bcl-2,and cIAP-1蛋白表达的测定，如图2所示，与吻合旁组织相比，狭窄组织中p56、bcl-2和ciap-1蛋白水平表达显著升高(P<0.05)。

表2 p56、bcl-2和ciap-1在狭窄组织和吻合口旁组织中的表达

图1 狭窄组织和吻合旁组织中p56、bcl-2和ciap-1的蛋白质表达 (IHC ×200)

3 讨论

吻合口狭窄是食管癌外科治疗的主要并发症。患者可因吞咽困难而出现严重营养不良或体重减轻[10]。通过既往文献报道，我们了解到导致吻合口狭窄的主要因素有以下两种：一种由张力导致：位于吻合口上的张力越大，发生狭窄的风险越高；另一种是炎症导致：刺激吻合口的炎症因素越多，发生狭窄的风险越高[11-13]。目前，食管狭窄的一级预防和治疗方法主要有：先进的吻合技术、树枝状扩张、球囊扩张、类固醇注射、丝裂霉素C切口和支架[14]。但是上述方法均无法完全治愈食管吻合口狭窄，且有高达40%的患者在治疗后几个月内复发狭窄，从而导致重复治疗[15]。吻合口狭窄是病理性增生的过程，若能在基因和分子水平上找到对应的治疗靶点，那么在吻合口狭窄的治疗上，将会有很大进展。

NF-κB是一种参与细胞增殖、自身免疫疾病和癌症发展的转录因子[7]。同时，NF-κB在纤维增生过程中起着重要作用。既往研究在瘢痕疙瘩成纤维细胞中检测到了NF-κB的过度表达，并且异常激活的NF-κB与许多炎症性疾病、感染和癌症有关[16]。通过文献研究，我们发现NF-κB信号通路与成纤维细胞增生有关[17]，[18]，过度表达高表达的NF-κB能激活抗凋亡基因，从而抵抗细胞死亡，最终导致吻合纤维增生和狭窄[19]。因此，我们深入研究了NF-κB信号通路在食管癌术后吻合口狭窄形成中的作用。

众所周知，NF-κB诱导各种抗凋亡基因的激活。在本研究中，我们检测了Bcl-2和CIAP-1的蛋白和miRNA以验证通路的激活。bcl-2基因在抑制多组织和细胞凋亡中起着关键作用，其主要机制包括：(1)拮抗凋亡基因bax；(2)抑制线粒体释放到细胞质中的凋亡细胞色素c；(3)阻止细胞色素c激活细胞质中的衣壳蛋白基因；(4)抗氧化和维持细胞凋亡。细胞内钙稳态[20]。同时我们也了解到Bcl-2在许多癌症中过度表达，并被NF-κB激活，因此Bcl-2可能是预防和治疗食管癌和术后吻合口狭窄的理想靶点。CIAP-1基因在抑制细胞凋亡中也起着重要作用，可以通过NF-κB调控，其抑制细胞凋亡的主要机制包括：(1)IAP能直接抑制衣壳3,7,9的活化；(2)IAP能通过特殊蛋白酶促进衣壳的降解[21]。研究人员ISSEI报道，CIAP-1表达过多，可能是由于细胞凋亡引起的。在食管鳞癌细胞中，messadi报道[9]，在瘢痕疙瘩的发育过程中，CIAP-1在成纤维细胞中的表达水平较高。因此，在本研究中，它与bcl-2具有相同的作用。因此，阻止NF-κB活化的作用可能不局限于成纤维细胞。

图2 p56、bcl-2和ciap-1蛋白在吻合口旁组织和狭窄组织中的表达

与吻合口旁组织相比，吻合口狭窄组织中p56、bcl-2、ciap-1表达水平明显升高。同时，吻合口狭窄患者正常组织中的p56、bcl-2和ciap-1高于非狭窄患者，提示狭窄的发展与NF-κB水平有关，抑制NF-κB下游基因和蛋白的表达或激活可能有利于降低术后发生率。众所周知，炎症可以激活NF-κB信号通路，加快吻合口增生的进程。因此提示术者在外科治疗食管癌患者时，应尽可能控制吻合口周围的炎症，如改进吻合技术，减少吻合口渗漏，术后定期进行抑酸治疗等。