苹果腐烂病菌对3种杀菌剂抗药性与敏感性检测

刘向阳

(陕西省延安市洛川县果树研究所，陕西洛川 727400)

洛川县是中国苹果优生区的核心地带[1]，苹果是洛川县的主导产业。近年来，洛川苹果树腐烂病(ValsamaliMiyabeet Yamada)的发生危害逐年加重[2]，防治主要以刮治、喷洒石硫合剂等杀菌剂为主，但效果并不明显[3]。笔者测定了洛川县10个乡镇的苹果树腐烂病分离菌株对常用的3种杀菌剂戊唑醇、嘧霉胺、苯醚甲环唑的抗药性和敏感性，为防治腐烂病提供参考。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

供试菌。由洛川县10个苹果主产乡镇的苹果树发病枝条上分离获得10个菌株(表1)。

表1 洛川县10个乡镇的苹果树腐烂病菌分离菌株

供试杀菌剂3种，430g/L戊唑醇悬浮剂(江苏龙灯化学有限公司)；400g/L嘧霉胺悬浮剂(永农生物科技有限公司)；40%苯醚甲环唑悬浮剂(利民化工股份有限公司)。

1.2 试验方法

PDA培养基制备。土豆400g，加蒸馏水2L，沸水煮30分钟，过滤去渣，加入蒸馏水补至体积2L，加琼脂40g，葡萄糖40g，煮至琼脂融化，倒入锥形瓶定容至200ml，以121℃加热30分钟灭菌备用。

含药培养基制备。将上述锥形瓶内PDA培养基置于微波炉内融化后放在无菌操作台上，将3种杀菌剂以1000μg/mL的药剂为母液进行8个浓度梯度稀释(10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078125μg/mL)后，加入到50℃左右的培养基中充分混匀，迅速倒入培养皿中制成含药的系列培养基平板[4]。

检测10个分离菌株对3种药剂的抗药性。采用最低浓度抑制法 (MIC)[5]，参照严红等[6]方法适当修改。将10个分离菌株分别接种到含有430g/L戊唑醇悬浮剂、400g/L嘧霉胺悬浮剂、40%苯醚甲环唑悬浮剂的PDA平板上，各药剂浓度均为10μg/mL。能在其上生长的视为抗性菌，不能生长的视为敏感菌。

测定10个分离菌株对3种药剂的敏感性。采用菌丝生长速率法[7]，将活化3天后的10个菌株用5mm打孔器分别接种到8个浓度梯度的含药培养基平板。3天后用十字交叉法测量菌落直径[8]。以不加农药的PDA平板做对照，处理和对照均重复3次。计算抑制率和毒力回归方程。数据采用Excel和DPS软件计算3种杀菌剂对10个分离菌株的EC50、毒力回归方程，相关系数及其置信区间。

抑制率(%)=(对照菌落直径均值-处理菌落直径均值)/(对照菌落直径均值-接种菌饼直径)×100

2 结果与分析

2.1 10个分离菌株对3种杀菌剂的抗药性

如表2，10个分离菌株对400g/L嘧霉胺均产生抗药性，均有菌落生长。10个分离菌株中，只有10号菌株对430g/L戊唑醇产生抗药性，有菌落生长，其余菌株未产生抗药性，无菌落生长。10个菌株对40%苯醚甲环唑均未产生抗药性，均无菌落生长。

表2 苹果树腐烂病10个分离株菌对3种杀菌剂的抗药性

注：+表示菌有抗药性，有菌落生长；-表示菌无抗药性，无菌落生长。

2.2 10个分离菌株对3种药剂的敏感性

如表3，3种药剂对10个分离菌株的EC50值：430g/L戊唑醇0.1385～0.5239μg/mL，大小值相差3.78倍(均值0.25μg/ml)；400g/L嘧霉胺0.3790～2.1340μg/mL，大小值相差5.63倍(均值1.13μg/ml)；40%苯醚甲环唑0.1229～0.3313μg/mL，大小相差2.70倍(均值0.20μg/ml)。表明10个分离菌株对40%苯醚甲环唑的敏感性差异最小，稳定性最好；对400g/L嘧霉胺敏感性差异最大，稳定性最差；对430g/L戊唑醇的敏感性和稳定性居中。

在表3的毒力回归方程中(方程是根据药剂不同浓度下菌落大小与对照比较，算出抑制率与含药浓度的关系，y代表抑制率，x代表药剂浓度)，3种杀菌剂在不同浓度下相关系数在0.8436～0.9992之间，其相关性为强相关性。

3 小结与讨论

由洛川10个乡镇的苹果树腐烂病分离菌株中，10个菌株对40%苯醚甲环唑悬浮剂均未产生抗药性。只有10号菌株对430g/L戊唑醇悬浮剂产生抗药性，其余9个菌株未产生抗药性。10个菌株对400g/L嘧霉胺悬浮剂均产生抗药性。10个分离菌株对40%苯醚甲环唑的敏感性差异最小，稳定性最优。对400g/L嘧霉胺的敏感性差异最大，稳定性最差。

3种杀菌剂对10个分离菌株的EC50值，400g/L嘧霉胺0.3790～2.1340μg/ml>430g/L戊唑醇0.1385～0.5239μg/ml>40%苯醚甲环唑0.1229～0.3313μg/ml。嘧霉胺的EC50值相对最大，说明其抑菌效果最差，戊唑醇的EC50值较大，抑菌效果较好；苯醚甲环唑的EC50值最小，抑菌效果最好。因此，建议生产上防治苹果树腐烂病时优先选用苯醚甲环唑。

本试验不足之处在于不能完全保证锥形瓶中只有200ml培养基，经过高压灭菌冷却后会出现一定偏差导致所配浓度不精准。周海波等人[9]研究了山西省不同地理来源的菌株敏感性无明显差异，本研究与其结果一致。索朗拉姆等人[10]测定苹果腐烂病对苯醚甲环唑敏感性得出的EC50值，本研究与其不一致，原因可能是所用药剂的有效成分含量不同。