发酵酱油中生物胺的产生及其控制研究进展

何一龙，刘晓艳 *，钱 敏，白卫东，黄汉聪

（1.仲恺农业工程学院 轻工食品学院，广东 广州 510225；2.广州市广式传统食品加工与安全控制重点实验室，广东 广州 510225；3.现代农业工程创新研究院，广东 广州 510225；4.广州市如丰果子调味食品有限公司，广东 广州 510300）

酱油（soy sauce）又称豉油，由“酱”演化而来，经过三千多年的发展，酱油早已成为日常烹饪过程中必不可少的调味品，并远传日本、韩国和东南亚一带[1]。酱油一般都要经过选料、蒸煮、曲霉菌制曲、下缸发酵和成熟出缸等阶段[2]，在发酵过程中曲霉释放大量蛋白酶，能够促进原料中蛋白质水解，并产生小分子肽和游离氨基酸[3]，小分子肽中多为特征滋味肽，有学者认为这些游离滋味肽和氨基酸一起赋予酱油独特的鲜味[4-6]。曲霉等微生物释放蛋白酶的同时也会代谢出其他酶，其中氨基酸脱羧酶能将游离氨基酸脱去羧基形成具有一定安全风险的生物胺（biogenic amines，BAs）。酱油在发酵过程中很容易产生BAs，导致酱油潜在的不安全性。BAs是一类具有生物活性的低分子生物碱，广泛存在于自然界中[7]，主要有脂肪族（腐胺、尸胺、精胺、亚精胺等）、芳香族（酪胺、苯乙胺等）和杂环族（组胺、色胺等）三大类[8]。食品中的BAs有内源性和外源性两条产生途径，内源性BAs主要由原料自身代谢产生，并承担部分生命活动，该途径多出现在非发酵食品及其原料中[9]。近年来人们更加关注外源性BAs，特别是微生物发酵食品。其含量往往与原料中蛋白含量有关，蛋白含量越高，发酵制品中检测到的各BAs含量也会越高[10]。

发酵类食品中的BAs主要有酪胺、β-苯乙胺、亚精胺、精胺、腐胺、尸胺、组胺、色胺、五羟基色胺和胍基丁胺等，由前体物质酪氨酸、β-苯乙氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、色氨酸、五羟基色氨酸脱羧而来[11]。通常人类摄入微量BAs不会对人体产生毒副作用，但在体内积累到一定程度时就会产生毒害作用（如外部血管膨胀导致高血压和头痛，以及肠道平滑肌的收缩造成腹部痉挛、腹泻和呕吐等）。BAs引起的食品安全问题，也就是BAs的毒性作用[12]。LINARES D M等[13]经过体外细胞毒性试验（HT29肠道细胞），发现酪胺比组胺对细胞的毒害作用更强更快，组胺诱导细胞凋亡，酪胺使细胞坏死。近年来，发酵酱油中BAs的存在逐渐成为人们关注的焦点。

1 发酵酱油中生物胺的形成机制及含量测定

BAs在生物体内的形成途径主要是氨基酸的脱羧反应，也有部分通过醛的胺化作用形成。食品中的BAs主要是由微生物在发酵或成熟过程中由微生物分泌的氨基酸脱羧酶作用于氨基酸而形成。微生物的氨基酸脱羧酶在5-磷酸吡哆醛为辅酶的条件下，脱去氨基酸中的羧基后形成相应的胺。一种氨基酸脱羧酶可能对几种氨基酸都能产生脱羧作用，如乳酸菌产生的组氨酸脱羧酶可以作用于多种氨基酸产生组胺、酪胺、腐胺等，产酪胺能力强的菌株同时也能产生苯乙胺。总的来说，食品中生物胺的形成有三个先决条件：①能分泌氨基酸脱羧酶的微生物的存在。②生物胺前体物质—氨基酸的存在。③适宜于相关微生物生长和分泌氨基酸脱羧酶的环境条件[14-15]。

1.1 发酵酱油中生物胺的种类及含量

不同类型的发酵酱油中BAs的种类和含量有所差异。LU Y M等[16]利用高效液相色谱法测定了华中、华南地区不同类型的40种市售酱油的BAs，发现总胺范围在41.7～1 357 mg/L之间，其中酪胺、组胺和尸胺含量最高，范围分别在0～673 mg/L、0～592 mg/L和0～550 mg/L之间，并且发现在高盐稀态酱油中尸胺、组胺、亚精胺含量均远高于低盐固态酱油，不同工艺生产的酱油BAs含量差异较大，这和发酵类型、环境（pH、温度、盐含量）和微生物种类相关。邹阳等[17]也利用相同方法对国内市售的10种酱油8种BAs含量进行检测，除部分高盐稀态酱油中未检出色胺外，其他生物胺均有检出。总胺范围在50.82～1 898.17 mg/L之间，被测在样品中酪胺、腐胺和β-苯乙胺含量最高，结果与李志军等[18-19]报道相同，表明β-苯乙胺、腐胺和酪胺是市售酱油中主要存在的BAs。SCHWAB M[20]指出食物中总胺含量的安全范围应该在0～1 000 mg/L之间，根据检测结果显示，有少量市售酱油样品中总胺含量超过最低安全范围，但绝大部分＜1 000 mg/L。不同地区的酱油发酵工艺存在较大差异，根据KIM J H等[21-22]在对韩日市售酱油中8种BAs进行检测后发现，被测样品中各BAs含量均低于安全限值20 mg/L。国内外不同区域酱油的发酵环境、工艺、优势菌株等因素差异较大，这导致了BAs含量差异也较明显。

1.2 发酵酱油中生物胺的测定

目前用于食品中BAs检测的方法主要有以下几种：高效液相色谱法、毛细管电泳法、气相色谱法、薄层色谱法、离子色谱法等。高效液相色谱法在BAs检测中运用最为广泛，具有分离效率和准确性高、稳定性和重现性好等特点。毛细管电泳法是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，根据待分离组分在毛细管中的分配系数不同进行分离的一种液相微分离技术，具有高效、快速等特点，通常结合紫外、荧光、电化学或者质谱检测器使用，但该方法对被测样品的要求较高，不能有杂质影响。BACALONI A等[23-24]利用毛细管电泳法检测酱油、啤酒、人体乳腺癌细胞和尿液中的BAs含量。气相色谱法是通过气液或气固两项相互运动过程中物质在两相之间分配系数差异来达到分离物质的目的，具有离能力好，灵敏度高等优点，由于分析时，被检测物需要气化，不同物质的沸点和热稳定性存在差异，因此与其他方法相比局限性更大。王芳等[25]利用气相色谱法测定了腌肉中5种BAs的含量，该法在运用于酱油中BAs的报道较少。薄层色谱法是一种快速、简单的低成本检测方法，可用于生物胺的快速定性或者半定量检测，但确定含量还需要萃取衍生后，通过荧光检测器测定BAs衍生物的含量[26]。离子色谱法可以运用于液体食品中BAs检测，具有分析过程简单、快速、重现性高的特点[23]。

1.3 发酵酱油中产生物胺的微生物

传统发酵酱油是以大豆和麸皮为主要原料经微生物发酵而来的浸出液，其中的微生物主要有三类：细菌、霉菌和酵母，这些微生物都可能与BAs的产生有关。从BAs的产生途径可知，除了部分来自于原料，其余都是在酱油发酵过程中产生。体系中微生物降解氨基酸有脱氨和脱羧两种方式，当环境的pH值偏低时，主要进行脱羧作用。对于各BAs来说，必然是某一种氨基酸脱羧作用的结果，但对于各氨基酸脱羧酶来说，可能分别对几种氨基酸都能产生脱羧作用。酱油的制曲以米曲霉或黑曲霉为主，下缸发酵以细菌和酵母为主[27]。发酵体系中微生物代谢产生的蛋白酶、肽酶和其他酶类将大豆蛋白质剪切成小分子肽和氨基酸，使得酱油汁液中含有较为丰富的游离氨基酸。有研究发现，市售酱油中游离氨基酸含量约为4.971～12.823 g/100 mL（除谷氨酸）[28]，酱油中游离氨基酸的存在为BAs的形成提供了条件。酱油发酵过程是不同微生物种群之间协同作用，在众多微生物中有部分菌株具有控制合成脱羧酶的基因，当条件满足时能够分泌氨基酸脱羧酶，成为产胺菌。酱油发酵过程中起主要作用的微生物包括曲霉菌、酵母菌和乳酸杆菌，曲霉菌主要促进酱醪中蛋白质等大分子生物活性物质分解，酵母菌和乳酸杆菌主要赋予酱油特定的香味和口感，发酵后期增脂增香[29]。随着对BAs研究的深入，有学者分离得到具有分泌氨基酸脱羧酶能力的菌株，主要为芽孢杆菌属和肠球菌属。朱天傲[30]分离得到的产胺芽孢杆菌菌株在培养基中产胺范围在1.09～70.14 mg/L；JEON A R等[31]对大豆制品研究分离得到芽孢杆菌菌株和肠球菌菌株，在检测培养基中产生的总胺分别为37.43 mg/L和141.74 mg/L，并且发现芽孢杆菌菌株产生组胺水平略低，但β-苯乙胺和酪胺水平明显高于肠球菌菌株；同时研究人员发现参与豆制品发酵的优势菌株，如曲霉菌、酵母菌、芽孢杆菌、乳酸杆菌和肠杆菌等在一定条件下具有产胺能力[32]。

2 酱油发酵过程中生物胺产生的影响因素

2.1 pH对BAs形成的影响

pH值是影响发酵食品的重要因素，也是影响发酵食品中BAs产生的关键因素之一。早在上世纪就有学者指出，BAs的形成是微生物为了能够在酸性环境中生存进化来的特殊反应机制。pH值是影响氨基酸脱羧酶活力的重要因素，微生物代谢产生的氨基酸脱羧酶在低pH环境中具有更强的活力，因此在酸性环境中生存的微生物具有更强大的产胺能力[21]。SILVA V L M等[33]研究发现，pH值的降低是导致发酵液中组胺和酪胺含量增加的主要原因。另外，TEODOROVI V等[34]报道了pH值为4.0～5.5时脱羧酶活力最高。酱油原料经拌盐下缸发酵，发酵液的pH值在6.5左右，偏中性，随着发酵的时间延长，温度的升高，pH值下降，酸性微生物代谢能力增强，氨基酸脱羧酶活性变强，同时水解产生的游离氨基酸增加，这样就可能为BAs的形成提供条件[35]。

2.2 温度对BAs形成的影响

温度主要是通过改变微生物的群落、数量以及酶的活性来影响BAs的富集。FRANK H A等[36]报道了具有组胺产生能力的微生物可以在较宽的温度范围内生长，并且在高温环境下具有更快的繁殖速度，但在相同高温下，乳酸菌比产胺微生物生存能力更强，更加具有竞争优势，抑制产胺菌生长，同时发酵液中各类型水解酶和脱羧酶在高温下活性增强，这又加快了BAs的生成速度。因此，酱油中各种BAs的含量与发酵温度之间关系较为复杂，并非成简单线性关系。BARGOSSI E等[37]通过对温度和酪氨酸脱羧酶活性的关系研究，发现在30～37 ℃的温度范围内酪氨酸脱羧酶脱羧能力最佳，效率最高。有学者研究了以米曲霉为发酵剂的鱼露中的BAs，发现发酵温度为40 ℃时，更有利于鱼露中BAs的产生[38]。发酵食品在加工过程中，醪液的温度与微生物繁殖代谢的最适温度越相近，对BAs的形成越有利，原因在于BAs的代谢途径与发酵过程中微生物的种群和数量相关[39]。酱油的发酵为各类耐盐微生物的生长代谢提供了合适温度，这有利于加快发酵速度，缩短生产时间，与此同时也为酱醪中BAs的积累创造了条件。

2.3 盐含量对BAs形成的影响

食盐主要通过改变发酵液中的渗透压来抑制产胺微生物的生长繁殖，同时高浓度的食盐可以破坏氨基酸脱羧酶的结构，致使其脱羧能力下降，从而降低发酵制品中BAs的积累。ROSEIRO L C等[40]报道称，BAs含量与NaCl浓度呈负相关。HENRY K D等[41]研究发现，日本豆面酱发酵过程中的食盐浓度在3.5%～5.5%范围内时对组胺的抑制效果最佳。KIM J H等[42]报道了微生物在高盐环境下比低盐环境下的产胺能力小，这是由于酱醪高盐环境下具有更高的渗透压，微生物的生长繁殖受到了抑制。HERNANDEZHERRERO M M等[43]从豆豉中分离得到了具有组胺产生能力的头状葡萄球菌（Staphylococcus capitis），可在NaCl浓度为0.5%～10%的条件下正常生长，在添加了胰酪蛋白胨的大豆肉汤（含1%的L-组氨酸）中培养该菌，经检测发现培养基中产生的组胺含量超过500 mg/kg；豆豉发酵过程中NaCl含量在0.5%～10%时对S.capitis产生组胺脱羧酶具有促进作用，当NaCl含量超过10%时S.capitis的生长繁殖变缓，超过20%时能够完全抑制该菌的生长以及组胺脱羧酶的代谢。曹忠娜[44]研究发现，高盐稀态酱油中将盐含量提高至20%，可有效降低BAs的产生。同时发现不同盐度（16%、18%和20%）条件下的BAs主要为精胺、亚精胺，其次为组胺和酪胺，盐含量20%组的总胺含量明显低于18%组和16%组，并且维持在100 mg/L以下，这说明适当提高盐含量对BAs的生成有一定抑制作用。

2.4 其他影响因素

除pH、温度和含盐量外，原料的品质也会对发酵酱油中BAs含量有一定影响。RIGHETTI L等[45]在研究植物源性食品中的BAs含量时发现，豆科植物的茎杆、花蕾和胚芽中都有BAs检出，大豆本身带有一定量的BAs，并且试验田的大豆中BAs含量更高。有学者研究证实了原料中大豆的种类和比例是影响发酵豆制品中BAs含量的因素之一[46]。此外，大豆原料受到微生物污染后，可能导致在发酵之前就存在一定量的BAs。因此，对原料质量的把控，是降低酱油中BAs含量重要手段之一。

3 酱油发酵过程中BAs的控制技术研究

3.1 发酵工艺的优化

酱油发酵过程中的温度和食盐浓度是影响成品酱油品质的两个关键因素，适当降低发酵温度至20～25 ℃有利于抑制产胺菌株的生长，并影响脱羧酶活性。含高浓度食盐的酱醪中渗透压会大大增加，产胺菌不能进行正常的代谢繁殖，这能够有效的减少BAs的富集。但高盐食品不满足于人们对健康饮食的要求，能够抑制BAs产生的同时找到安全的食盐添加量至关重要。有文章报道[47]，意大利奶酪发酵过程中施以一定高压，能够改变包括具有产胺能力在内的有害微生物细胞膜蛋白的结构，并抑制其正常代谢，达到减少BAs富集的目地。

3.2 安全的发酵菌株

BAs在发酵食品中大量存在，近年来有研究人员提出利用生物技术来控制BAs在发酵食品中的积累，即使用安全的发酵制剂。FABRIZIA T等[48]成功从羊奶酪中分离出不会产生酪胺和组胺的干酪乳杆菌（L.casei）A422和酪黄肠球菌（E.casseliflavus）A143，并通过实验发现菌株A422和A143对酪胺和组胺具有出色的降解能力。VENDULA P等[49]探究了梭状芽孢杆菌（Lb.curvatus）和类干酪乳杆菌（Lb.paracasei）对发酵制品中BAs含量的影响，通过与传统产胺乳酸亚弧菌对比发现Lb.curvatus和Lb.paracase不产BAs，并且对乳酸亚弧菌的生长具有抑制作用。另外，KIM S Y等[50]以4株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）CB-1、CB-5、CB-16和CS-1217作为发酵剂可有效降低韩国酱油（Cheonggukjang）中8种BAs的含量，并且对酱醪中产胺菌株蜡样芽孢杆菌的繁殖代谢抑制效果明显。同时SUN Q等[51]研究发现，添加植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）的混合发酵剂能够显著降低发酵制品中组胺、色胺、尸胺、腐胺、β-苯乙胺和酪胺的含量，同时能够抑制产胺肠杆菌的生长。因此，将作用于酱油发酵的上述菌株优化后作为新型发酵剂，能够增加抑制成品中BAs富集的可能性。

3.3 添加BAs抑制剂

在酱油的发酵过程中适当加入具有抑菌功能的天然活性物质，可以对酱醪中产胺微生物生长起到一定抑制作用。玫瑰多酚是一种具有抗菌活性的天然物质，ZHANG Q Q等[52]研究发现，一定浓度的玫瑰多酚能够有效降低发酵制品中BAs的生成和腐败菌的生长，同时提高乳酸菌的生长速度和丰富度，降低产胺菌脱羧酶的代谢能力，提高发酵食品的食用安全性。SHUKLA S等[53]研究了大蒜、莲藕、银杏叶复合提取物对传统韩国大酱（Doenjang）的中间原料豆粕（Meju）的食品安全性影响，结果发现添加了复合提取物的样品中的BAs含量远低于美国食品与药物管理局、韩国食品药品管理局和欧洲食品安全局规定的安全限值，研究发现，该复合提取物抑制了豆粕中产胺微生物的生长，降低了氨基酸脱羧酶活性。也有学者通过添加红花和苦瓜提取物、豌豆二胺氧化酶等[54]天然物质来抑制发酵制品中BAs的产生，香料中的姜黄素、辣椒素、麝香草酚和胡椒碱同样是能够抑制BAs产生的天然提取物。

4 总结

通过对有关市售酱油中BAs含量检测报道的研究发现，部分酱油中BAs含量超过国际建议安全限量，对健康造成威胁。酱油中的BAs主要与发酵过程中多种产胺微生物对游离氨基酸的利用有关，微生物分泌的氨基酸脱羧酶作用于游离氨基酸，形成相应的BAs。酱油中BAs的含量同时受发酵环境中pH值、温度和含盐量的影响。其发酵过程在生物代谢作用下，pH下降，并伴随温度变化，氨基酸脱羧酶活力也会发生变化。添加BAs抑制剂可看作优化传统发酵工艺的一部分，两者都是通过改善发酵环境来达到抑制BAs产生的目的。适合的BAs抑制剂，适当的降低发酵温度，科学的增加含盐量，改变体系渗透压，抑制产胺微生物生长代谢，从而降低BAs产生的风险；同时，在酱油发酵菌株中，对低产胺菌株进行筛、优化和改良，培育出安全高效的发酵菌株。酱油的发酵过程是由多系统共同作用（及发酵条件、环境影响、发酵液营养和微生物多样性等），其工艺复杂。因此，将三种控制技术共同作用，并且找到三者的平衡点，并合理的利用，能够极大限度的减少酱油中BAs的产生，对增加酱油的食用安全性具有重要意义。