没食子酸脱羧酶及酶法制备焦性没食子酸研究进展

张亮亮，汪咏梅*，徐曼，陈笳鸿

（1.中国林业科学研究院林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业局林产化学

工程重点开放性实验室；江苏省生物质能源与材料重点实验室，江苏南京 210042；2.中国林业科学研究院林业新技术研究所，北京 100091）

没食子酸脱羧酶及酶法制备焦性没食子酸研究进展

张亮亮1，2，汪咏梅1，2*，徐曼1，陈笳鸿1

（1.中国林业科学研究院林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业局林产化学

工程重点开放性实验室；江苏省生物质能源与材料重点实验室，江苏南京 210042；2.中国林业科学研究院林业新技术研究所，北京 100091）

对没食子酸脱羧酶及酶法制备焦性没食子酸研究进展进行了介绍和综述，重点介绍了产没食子酸脱羧酶的微生物种类、发酵时间、底物浓度、pH值、温度、金属离子，氮源及接种量等对微生物发酵产高活性没食子酸脱羧酶的影响因素，并简述了酶法制备焦性没食子酸的方法，指出了今后的研究方向。

没食子酸；焦性没食子酸；没食子酸脱羧酶；单宁酶

焦性没食子酸，又称焦蒬酚或连苯三酚，是一种具有多种用途的化学试剂和化工原料，广泛用于医药合成、染料、食品、农药及电子产品等，作为显影剂、热敏剂、高分子材料的助剂以及化学分析试剂等。目前焦性没食子酸的市场需求量为600 t／a左右，全国年产量为200～500 t／a，还满足不了市场需求。生产焦性没食子酸的主要原料是没食子酸。没食子酸主要由五倍子、塔拉等的提取物经水解后制得的。没食子酸受热脱羧后生成焦性没食子酸。在我国，目前焦性没食子酸主要采用化学法进行制备，其制备工艺主要有两种［1－3］：一种是对没食子酸直接高温脱羧，该工艺需要在高温下进行人工翻炒，不仅劳动强度大，产品得率较低，质量也不稳定。另一种是采用催化剂对没食子酸进行加热催化脱羧，该工艺具有得率高、操作简便的优点，但产品中容易残留微量催化剂。而微生物酶法则有助于解决上述弊端，因此，建立酶法制取焦性没食子酸的新工艺具有“绿色”化学化工加工新工艺的重要意义。国外最早是日本学者从20世纪80年代初发现没食子酸脱羧酶并开始研究微生物酶法制备焦性没食子酸，国内目前尚未见到相关技术研究的报道。

1 产没食子酸脱羧酶的微生物

单宁酸可在单宁酶的作用下发生降解生成没食子酸，没食子酸可在没食子酸脱羧酶（GAD）的作用下发生脱羧反应生成焦性没食子酸［4－6］，反应过程见图1。

图1 单宁酸生物降解过程Fig.1 Degradation of tannic acid

目前已从多种细菌中分离得到没食子酸脱羧酶，已报道的能够产生没食子酸脱羧酶的细菌主要有成团泛菌（Pantoea agglomerans），弗氏柠檬酸菌（Citrobacter freundiiTB3），柠檬菌株（Citrobactersp.），肠杆菌（Enterobacterspp.），月形单胞菌（Selenomonasspp.）和链球菌（Streptococcusspp.）等［5，7－11］，有些微生物种类不仅能产生没食子酸脱羧酶同时也能产生单宁酶，如链球菌（Streptococcus gallolyticus），隆派恩菌（Lonepinella koalarum），植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），类植物乳杆菌（Lactobacillus paraplantarum），戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）和成团泛菌（Pantoea agglomerans）等［5，12－14］。除细菌外还发现一株酵母菌Rhodotorula glutinis也可以产生没食子酸脱羧酶［15］。表1列出了已报道的能够产生没食子酸脱羧酶的微生物及其参考文献。已经公开的有关没食子酸脱羧酶及酶法制备焦性没食子酸的专利仅有4项，见表2，均为日本研究人员在20世纪八九十年代所申请。

目前发现的产没食子酸脱羧酶的菌株主要为肠杆菌属（Enterobacter）、泛菌属（Pantoea）和柠檬酸杆菌属（Citrobacter）。这类细菌见于人和动物的粪便，或是正常肠道栖居菌，也见于土壤、水、污水和食物中。能发酵葡萄糖产酸产气，为革兰氏阴性的兼性厌氧杆菌，有周鞭毛，可以活动。

表1 产没食子酸脱羧酶的微生物Table 1 Microbial sources of gallic acid decarboxylase（GAD）

表2 已发表的没食子酸脱羧酶制备和应用的专利Table 2 Published patents regarding to GAD production and application

2 没食子酸脱羧酶活性的影响因素

Soni等［9］研究了肠杆菌Enterobacter spp.发酵没食子酸产没食子酸脱羧酶的条件及酶活性的影响因素。分别考察了发酵时间、底物浓度、缓冲液浓度、pH值、发酵温度、金属离子种类及浓度、氮源、搅拌速度和接种量对焦性没食子酸产量及没食子酸脱羧酶活性的影响。

2.1 发酵时间的影响

发酵时间对焦性没食子酸的产量及没食子酸脱羧酶的活性影响较大。经20 h发酵后焦性没食子酸的产量及没食子酸脱羧酶的活性均达到最大值，分别为190 μg／mL和0.193 U／mL［9］。发酵4、8及20 h后取样分析，焦性没食子酸产量分别为10.54、13.33及15.81 μg［9］。Yoshida等［21］研究发酵时间对柠檬菌株（Citrobacterspp.）产没食子酸脱羧酶的影响时发现，发酵48 h后没食子酸脱羧酶的产率达到最大，没食子酸的最大转化率为69.8%。Zeida等［5］研究成团泛菌（Pantoea agglomerans）产没食子酸脱羧酶发现在反复震荡培养条件下，发酵24 h后发酵产物中没食子酸脱羧酶含量达到最高。

2.2 底物浓度及磷酸缓冲液的影响

以没食子酸作为唯一碳源进行微生物发酵时，当没食子酸底物质量分数为0.2%时肠杆菌（Enterobacterspp.）产没食子酸脱羧酶酶活达到最高（0.156 U／mL），同时胞外蛋白浓度达到最大值（62.45 mg／L）［9］。Zeida等［2］研究发现当没食子酸底物浓度为3 g／L时成团泛菌（Pantoea agglomerans）产没食子酸脱羧酶酶活最高。通过对发酵液中不同缓冲液体系的比较研究发现，在发酵液中添加磷酸盐缓冲液发酵产物中没食子酸脱羧酶酶活最高。发酵液中磷酸盐缓冲液浓度为30 mmol／L时发酵产物中没食子酸脱羧酶活性最高（0.137 U／mL），蛋白质含量为54.67 mg／L［9］。

2.3 pH值及发酵温度的影响

发酵生产没食子酸脱羧酶过程中，pH值能够显著的影响发酵产生的蛋白质含量和没食子酸脱羧酶活性。当pH值为6.6时，肠杆菌（Enterobacterspp.）发酵产没食子酸脱羧酶发酵产物中蛋白质含量最大且产生的没食子酸脱羧酶酶活最高，蛋白质含量及没食子酸脱羧酶活性分别为52.45 μg／mL和0.131 U／mL［9］。发酵时pH值的控制对微生物生长、没食子酸脱羧酶的产率及发酵原料的降解都起到至关重要的作用。文献报道不同的细菌发酵产高活性没食子酸脱羧酶的最适宜pH值范围为5～6.6之间。

发酵温度对没食子酸脱羧酶的产率及活性同样具有很大的影响。Soni等［9］考察了不同发酵温度（25、30、35、40和45℃）对肠杆菌（Enterobacterspp.）发酵产没食子酸脱羧酶产量及活性的影响，发现最佳发酵温度为30℃，在此温度下发酵产物中胞外蛋白质浓度及没食子酸脱羧酶的活性最大，分别为42.42 mg／L和0.106 U／mL。

2.4 金属离子的影响

Soni等［9］以没食子酸为底物，研究了不同金属离子（Fe2＋、Cu2＋、Mg2＋、Co2＋、Mn2＋、K＋及Zn2＋）对肠杆菌（Enterobacterspp.）发酵产物中胞外蛋白质含量及没食子酸脱羧酶产率的影响。发现Mg2＋对发酵过程影响最大，当有Mg2＋存在的条件下发酵产物中没食子酸脱羧酶的含量最高，为0.175 U／mL，同时发酵产物中胞外蛋白质含量最高，为70.29 mg／L。且进一步研究发现当0.06%Mg2＋时发酵产物中没食子酸脱羧酶及蛋白质含量最高，分别为0.164 U／mL和65.75 mg／L。Yoshida等［21］研究了以没食子酸为底物，利用柠檬菌株（Citrobacterspp.）发酵产没食子酸脱羧酶的过程，发现在发酵原料中添加0.05%的MgSO4得到发酵产物中没食子酸脱羧酶含量最高。Kumar等［7］发现在发酵原料中添加浓度为0.5 mol／L的MgSO4同样能够促进弗氏柠檬酸菌（Citrobacter freundiiTB3）发酵产没食子酸脱羧酶的产率。Zeida等［5］研究发现每升发酵原料中添加0.5 g的MgSO4·7H2O和0.01 g的FeSO4·7H2O可促进成团泛菌（Pantoea agglomerans）发酵产没食子酸脱羧酶的产率。

2.5 氮源的影响

Soni等［9］通过在发酵原料中添加硝酸铵，氯化铵及硫酸铵3种不同氮源，考察了不同氮源对发酵产物中蛋白质含量及没食子酸脱羧酶产率的影响。发现在发酵原料中添加0.04%（NH4）2SO4作为发酵氮源时得到发酵产物中没食子酸脱羧酶活性最高，为0.101 U／mL，蛋白质含量也最高，为43.11 mg／L。在利用微生物发酵产没食子酸脱羧酶过程中，通常添加NH4Cl作为氮源。

2.6 搅拌速率及接种量的影响

研究发现搅拌速率对微生物发酵产没食子酸脱羧酶具有一定的影响，当搅拌速率为150 r／min时，发酵产物中没食子酸脱羧酶活性最高，为0.095 U／mL，焦性没食子酸含量也达到最高，为37.92 mg／L。Soni等［9］研究了在含有100 mL发酵原料的三角瓶中分别按照1%、2%、3%、4%、5%和6%的接种量进行接种培养。发现当接种量为5%时发酵产物中没食子酸脱羧酶和蛋白质含量最高，分别为0.057 U／mL和22.64 mg／L。

3 酶法制备焦性没食子酸研究状况

Yoshida等［8］研究了酶法制备焦性没食子酸的生物脱羧过程：柠檬菌株（Citrobactersp.）在28℃下培养24 h后，加入7.5%没食子酸引发反应。为避免底物氧化及氧气引起的其它副反应，反应操作应在无氧条件下进行，加入少量L-抗坏血酸作除氧剂，调pH值为4.5，加入没食子酸即有大量CO2气体放出。每2 h取一次样分析，8 h后停止。产物经离心沉降、溶剂萃取、再蒸发溶剂即得焦性没食子酸，焦性没食子酸产率达到97.4%。

Soni等［9］报道了肠杆菌（Enterobacterspp.）30℃下在含有0.2%没食子酸、0.4%（NH4）2SO4、0.05%MgSO4、pH值为6.6、30 mmol／L磷酸盐作为缓冲液的培养液中培养20 h，可得到焦性没食子酸产品。Kumar等［7］设计了一种能够进行连续发酵控制的圆柱形生物反应器，将弗氏柠檬酸菌（Citrobacter freundii）固定到κ-型卡拉胶（κ-carrageenan）上进行没食子酸连续脱羧反应制备焦性没食子酸，控制发酵混合液以0.5 mL／min的流速通过反应器进行没食子酸脱羧反应，得到发酵产物中焦性没食子酸最高含量为7.3 g／L，焦性没食子酸的转化率达到98.5%。

Shinya等［23］从土壤中分离得到一株能够产生没食子酸脱羧酶的细菌成团泛菌（Pantoea agglomerans），并研究了没食子酸脱羧酶制备焦性没食子酸的脱羧过程。发现没食子酸脱羧酶酶活的最佳条件为：pH值5.5～6.5，温度50℃。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析没食子酸脱羧酶分子量为58 ku，经凝胶渗透色谱-液相色谱法分析没食子酸脱羧酶分子量为442 ku，经氨基酸序列测定其N-末端氨基酸序列为Ser-Asn-Thr-Gln-Asn-Leu-Pro-Ala-Asn-Asp-Val-Tyr-Asp-Leu-Arg。

最早研究酶法制备焦性没食子酸，是利用微生物发酵没食子单宁（gallotannin）或塔拉单宁（tara tannin）来制备焦性没食子酸。但这类脱羧反应过程非常缓慢，只有25.8%的没食子单宁（发酵液中为1%的没食子单宁）和28.5%的塔拉单宁（发酵液中为1%的塔拉单宁）转化为焦性没食子酸［8］。之后研究人员开始直接以没食子酸为底物，研究微生物发酵制备焦性没食子酸，焦性没食子酸的产率得到了提高，经发酵条件优化后焦性没食子酸的转化率普遍能达到90%以上。除了以植物单宁或没食子酸为原料制备焦性没食子酸外，近年来有研究者利用重组大肠杆菌（Escherichia coliKL7／pSK6.161）以自然界资源更为丰富的葡萄糖为原料，合成了没食子酸和焦性没食子酸［24］。在该反应中葡萄糖转化为没食子酸的转化率为12%，没食子酸转化为焦性没食子酸的转化率达到了93%～97%。

4 小结与展望

采用微生物发酵法对没食子酸脱羧制备焦性没食子酸的研究已经在国外进行了多年，筛选出了多种具有高效没食子酸脱羧能力的微生物菌株。这些研究主要集中在产高活性没食子酸脱羧酶菌株的筛选和酶法制备焦性没食子酸发酵条件的优化上。目前国内尚未见到酶法制备焦性没食子酸产业化的报道。这是因为没食子酸脱羧酶的应用还受到一定程度的限制，有些细菌产生的没食子酸脱羧酶酶活太低而没有实用价值，有些酶活虽高却没有合适的应用手段等条件的制约。对于前者，可以借鉴单宁酶的研究手段运用物理、化学诱变、原生质体融合以及分子克隆和遗传工程手段改良菌种。目前国际上尚未见到这方面的研究报道，这是目前该领域需要重点研究的工作。对于后者，人们正通过酶的固定化等方法加以克服。对单宁酶及其应用的研究国内已有大量报道。但国内至今仍未见到没食子酸脱羧酶及酶法制备焦性没食子酸的相关报道。目前，产高活性没食子酸脱羧酶菌株的筛选及酶法制备焦性没食子酸技术的研究已列为国家863研究课题计划。相信随着对没食子酸脱羧酶的深入研究，必将促进我国五倍子加工产业的发展。

［1］李兰英，李玉新，杨雄辉.焦性没食子酸的制备和用途［J］.湖南化工，1991（4）：13－15.

［2］程从球，王亚兵.焦性没食子酸制备新工艺的研究［J］.林产化学与工业，1994，14（4）：15－18.

［3］杜运平，张宗和.焦性没食子酸的制备方法及应用［J］.生物质化学工程，2011，45（1）：47－52.

［4］HASLAM E，HAWORTH R，JONES K，et al.Gallotannins.Introduction：and the fractionation of tannase［J］.Journal of the Chemical Society（Resumed），1961：1829－1835.

［5］ZEIDA M，WIESER M，YOSHIDA T，et al.Purification and characterization of gallic acid decarboxylase from Pantoea agglomerans T 71［J］.Applied and Environmental Microbiology，1998，64（12）：4743－4747.

［6］BRUNE A，SCHINK B.Phloroglucinol pathway in the strictly anaerobic Pelobacter acidigallici：fermentation of trihydroxybenzenes to acetate via triacetic acid［J］.Archives of Microbiology，1992，157（5）：417－424.

［7］KUMAR R A，JAYARAMAN A，LAKSHMANAN M，et al.Bioconversion of gallic acid into pyrogallol by immobilized Citrobacter freundii TB3［J］.Journal of Fermentation and Bioengineering，1992，74（3）：159－162.

［8］YOSHIDA H，YAMADA H.Microbial production of pyrogallol through decarboxylation of gallic acid［J］.Agricultural and Biological Chemistry，1985，49（3）：659－663.

［9］SONI M，SHARMA K P，JOHN P.Characterization of pyrogallol production from gallic acid by Enterobacter spp［J］.Journal of Microbiology and Biotechnology Research，2012，2（2）：327－336.

［10］ODENYO A A，BISHOP R，ASEFA G，et al.Characterization of tannin-tolerant bacterial isolates from East African ruminants［J］.Anaerobe，2001，7（1）：5－15.

［11］O′DONOVAN L，BROOKER J D.Effect of hydrolysable and condensed tannins on growth，morphology and metabolism of Streptococcus gallolyticus（S.caprinus）and Streptococcus bovis［J］.Microbiology，2001，147（4）：1025－1033.

［12］OSAWA R，FUJISAWA T，SLY L I.Streptococcus gallolyticus sp.nov.；gallate degrading organisms formerly assigned to Streptococcus bovis［J］.Systematic and Applied Microbiology，1995，18（1）：74－78.

［13］OSAWA R，RAINEY F，FUJISAWA T，et al.Lonepinella koalarum gen.nov.，sp.nov.，a new tannin-protein complex degrading bacterium［J］.Systematic and Applied Microbiology，1995，18（3）：368－373.

［14］KAR B，BANERJEE R，BHATTACHARYYA B.Effect of additives on the behavioural properties of tannin acyl hydrolase［J］.Process Biochemistry，2003，38（9）：1285－1293.

［15］GUPTA J，JEBSEN C，KNEIFEL H.Sinapic acid degradation by the yeast Rhodotorula glutinis［J］.Journal of General Microbiology，1986，132（10）：2793－2799.

［16］GRANT D，PATEL J.The non-oxidative decarboxylation of p-hydroxybenzoic acid，gentisic acid，protocatechuic acid and gallic acid by Klebsiella aerogenes（Aerobacter aerogenes）［J］.Antonie Van Leeuwenhoek 1969，35（1）：325－343

［17］HADDOCK J D，FERRY J G.Initial steps in the anaerobic degradation of 3，4，5-trihydroxybenzoate by Eubacterium oxidoreducens：characterization of mutants and role of 1，2，3，5-tetrahydroxybenzene［J］.Journal of Bacteriology，1993，175（3）：669－673.

［18］KRUMHOLZ L，CRAWFORD R，HEMLING M，et al.Metabolism of gallate and phloroglucinol in Eubacterium oxidoreducens via 3-hydroxy-5-oxohexanoate［J］.Journal of Bacteriology，1987，169（5）：1886－1890.

［19］NAKAJIMA H，OTANI C，NIIMURA T.Decarboxylation of gallate by cell-free extracts of Streptococcus faecalis and Klebsiella pneumoniae isolated from rat feces［J］.Journal of the Food Hygienic Society of Japan，1992（33）：371－377.

［20］SAMAIN E，ALBAGNAC G，DUBOURGUIER H C.Initial steps of catabolism of trihydroxybenzenes in Pelobacter acidigallici［J］.Archives of Microbiology，1986，144（3）：242－244.

［21］YOSHIDA H，TANI Y，YAMADA H.Isolation and identification of a pyrogallol producing bacterium from soil［J］.Agricultural and Biological Chemistry，1982，46（10）：2539－2546.

［22］SHARMA K P，JOHN P.Purification and characterization of tannase and tannase gene from Enterobacter sp.［J］.Process Biochemistry，2011，46（1）：240－244.

［23］SHINYA M，YASUSHI H，KIKUO W，et al.Gallic Acid Decarboxylase and Production of Pyrogallol：JP 19970222339［P］.1997.

［24］KAMBOURAKIS S，DRATHS K M，FROST J W.Synthesis of gallic acid and pyrogallol from glucose：Replacing natural product isolation with microbial catalysis［J］.Journal of the American Chemical Society，2000，122（37）：9042－9043.

Research Progress on Gallic Acid Decarboxylase and Microbial Production of Pyrogallol through Decarboxylation of Gallic Acid

ZHANG Liang-liang1，2，WANG Yong-mei1，2，XU Man1，CHEN Jia-hong1
（1.Institute of Chemical Industry of Forest Products，CAF；National Engineering Lab.for Biomass Chemical Utilization；Key and Open Lab.of Forest Chemical Engineering，SFA；Key Lab.of Biomass Energy and Material，Jiangsu Province，Nanjing 210042，China；2.Research Institute of Forestry New Technology，CAF，Beijing 100091，China）

The gallic acid decarboxylase and microbial production of pyrogallol through decarboxylation of gallic acid was reviewed.Main focuses were enzyme-producing strains and the factors influencing the activities of gallic acid decarboxylase，such as time，concentration of gallic acid，pH value，temperature，metal ions，nitrogen sources and inoculums size.Finally，methods of microbial production of pyrogallol through decarboxylation of gallic acid were introduced briefly.The future study direction was pointed out.

Gallic acid；Pyrogallol；Gallic acid decarboxylase；Tannase

TQ35

A

1673-5854（2014）04-0035-05

10.3969／j.issn.1673-5854.2014.04.007

2013-10-24

国家863计划资助（SS2014AA021802）

张亮亮（1981—），男，江苏沭阳人，博士，副研究员，主要从事植物化学研究；E-mail：zhll20086＠gmail.com

*通讯作者：汪咏梅，副研究员，主要从事植物资源化学利用研究；E-mail：njlhswym＠163.com。