乳脂对发酵乳风味的影响

罗天淇，蔡淼，王世杰，朱宏，杨贞耐,*

（1.北京工商大学，北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京100048；2.石家庄君乐宝乳业有限公司，河北石家庄050221）

作为牛乳的重要组分，乳脂不仅对牛乳的物理特性（色泽、透明度等）、结构特性（质地、黏稠度）、传热性和非感官效果（饱腹感）起关键作用，而且是牛乳中重要的风味物质前体[1-3]。正常情况下牛乳中的脂肪酸绝大部分都以甘油三酯的形式存在，没有气味，但是热处理和乳酸菌发酵会加快乳脂降解，以醛类、酮类为主的脂质降解产物会增强来自乳脂的风味，对牛乳风味有较大影响，甚至使牛乳带有不新鲜甚至腐臭的气味[4-5]。

同时，乳脂还是牛乳中风味物质的重要载体及释放调节物质[6]。牛乳中风味物质的释放主要受化合物挥发性（热力学因素）和从乳液到气相的传质阻力（动力学因素）2 个因素的控制[7]。热力学因素决定风味物质在平衡状态下在基质中的保留或分配，而动力学因素影响风味物质在食物中的释放速率。简单来说，牛乳中风味化合物的释放包括在油相、油水界面、水相及顶空4 部分之间的分配和传质。由于牛乳中挥发性风味化合物或多或少地分布在脂肪相中，其释放主要取决于化合物的疏水性强弱及脂肪含量，对于亲脂物质，脂肪含量的变化会改变这些化合物的释放速率和顶空浓度，影响食用时的感知效果[8-9]。

目前相关研究大多集中于乳脂对发酵乳感官特性及与某些风味物质相互作用的影响，而对发酵乳整体风味组成与含量变化的影响报道极少。本研究通过制备不同乳脂含量的牛乳进行发酵，系统研究比较乳脂含量引起的发酵乳风味差异，探讨这些差异的来源，为进一步了解乳脂在发酵乳风味形成中的作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜牛乳北京三元食品股份有限公司；发酵剂YO-MIX 300 LYO（保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌）丹麦Danisco公司。

1.2 仪器与设备

Nova-Safety盖勃离心机 德国Gerebe公司；FT1乳成分分析仪丹麦Foss公司；MLS-3781L-PC高压蒸汽灭菌锅日本Sanyo公司；DHP-9032电热恒温培养箱上海一恒科学仪器有限公司；iCinac乳品发酵监控仪法国AMS Alliance公司；Rheolaser Master光学微流变仪法国Formulaction公司；7890A-7000气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪美国Agilent公司；CT3质构仪美国Brook field公司。

1.3 方法

1.3.1 不同乳脂含量发酵乳的制备

使用离心机离心（60 ℃，4 000 r/min、15 min）鲜牛乳得到乳脂，将乳脂加入鲜牛乳中复配，并使用乳成分分析仪测定组分，使牛乳中乳脂含量分别为3.7%、3.9%、4.1%、4.3%、4.5%，其余组分含量相同；将不同乳脂含量的牛乳在65 ℃条件下杀菌30 min，冷却至室温，加入商业发酵剂YO-MIX 300 LYO，42 ℃发酵4 h后冷却，置于4 ℃后熟24 h后进行相关指标测定。

1.3.2 发酵乳pH值及氧化还原电位测定

采用iCinac乳品发酵监控仪对发酵过程中牛乳的pH值和氧化还原电位进行实时监测，每1 min记录1 次。

1.3.3 发酵乳微流变性质测定

取20 mL发酵乳至微流变仪专用样品池中，将样品池插入微流变仪，运行测试程序，测定发酵乳在1 Hz下的弹性模量（G’）和黏性模量（G’）。

参考庞志花等[10]的方法，使用质构仪进行质地剖面分析（texture pro file analysis，TPA）。选用圆柱形TA10探头，目标值10.0 mm，触发点负载5.0 g，测试速率0.5 mm/s。

1.3.4 发酵乳挥发性风味物质测定

固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）法提取挥发性风味物质：萃取前将SPME纤维置于GC-MS仪进样口老化；取10 g发酵乳样品和1 μL内标物2-甲基-3-庚酮于30 mL萃取瓶中，内标物质量浓度为0.816 μg/μL，加盖密封，40 ℃恒温水浴平衡30 min后，将SPME纤维通过瓶盖插入样品瓶中的顶空部分，推出纤维，顶空吸附30 min后拔出；快速插入GC-MS仪进样口解吸5 min，进行GC-MS分析。

GC条件：采用DB-wax色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）进行分析。升温程序：起始柱温40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升温至200 ℃，以10 ℃/min升温至230 ℃，保持3 min，载气为氦气，流速1.2 mL/min，不分流进样。

MS条件：电子轰击离子源，电子能量70 eV，传输线温度280 ℃，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，质量扫描范围40～250（m/z）。

定性分析：化合物通过NIST 14质谱数据库进行质谱定性，通过比较实际保留指数（retention index，RI）与文献报道RI进行定性，差值小于50认为是同一物质。文献报道RI通过NIST Chemistry WebBook网站（https://webbook.nist.gov/chemistry/cas-ser/）查询，实际RI在分析样品中添加C9～C26正构烷烃内标物后，根据式（1）计算。

式中：n和n+1分别为未知物流出前、后正构烷烃的碳原子数；t’（i）为待测组分的调整保留时间（t’（n）＜t’（i）＜t’（n+1））；t’（n）和t’（n+1）分别为具有n和n+1个碳原子正构烷烃的保留时间。

定量分析：使用2-甲基-3庚酮为内标物，采用内标法进行定量分析，各挥发性成分含量按式（2）计算。

式中：Ci为未知物含量/（ng/g）；S未、S内分别为未知物、内标物的峰面积；ρ内为内标物质量浓度/（μg/μL）；V内为内标物添加体积/μL；m为样品质量/g。

1.4 数据处理

每个样品至少测定3 次，使用OriginPro 2017软件作图，风味物质用NIST 14谱库检索，并应用Canoco 4.5统计分析软件对数据进行主成分分析，使用SPSS 17.0软件进行相关性分析。风味化合物的油水分配系数lgP通过ChemSpider网站（http://www.chemspider.com）查询。

2 结果与分析

2.1 不同乳脂含量牛乳发酵过程中pH值的变化

图1 不同乳脂含量牛乳发酵过程中pH值的变化Fig. 1Changes in pH value of fermented milk during fermentation

由图1可知，不同乳脂含量牛乳发酵时的pH值曲线变化趋势相同，呈先下降后趋于平稳的趋势，并且整个发酵过程中各组样品的pH值均无明显差异。由于牛乳发酵过程中的pH值变化是乳酸菌代谢乳糖产生乳酸引起的，因此不同样品间乳脂含量的差异不会影响乳酸菌在发酵过程中产酸。

2.2 不同乳脂含量发酵乳的流变和质构特性

流变和质构特性是反映发酵乳结构特征的重要指标，G’和G”分别用于描述样品的类固体（弹性）特征和类流体（黏性）特征。

表1 发酵乳的流变及质构特性Table 1 Rheological and textural properties of fermented milk

由表1可知，所有发酵乳的G’均大于G”，表明发酵乳中弹性成分占优势，样品表现出类固体的特征[11]。随着乳脂含量的增加，发酵乳的G’、G”均显著降低（P＜0.05）；而质构特性方面，发酵乳硬度、内聚性变化较小，胶着性显著增加（P＜0.05）。

2.3 不同乳脂含量发酵乳风味物质分析

2.3.1 不同乳脂含量发酵乳的风味物质组成

表2 发酵乳挥发性组分的定性及定量分析结果Table 2 Qualitative and quantitative analysis results of volatiles in fermented milk ng/g

由表2可知，经过SPME萃取，GC-MS检测分析后，从5 组发酵乳中共检出挥发性物质34 种，包括烃类6 种、醇类1 种、醛类4 种、酮类6 种、酯类2 种、酸类9 种、其他化合物6 种。酸类物质的含量在各组样品中均为最高，随着乳脂含量的增加，酸类物质含量先上升后下降，酮类物质含量先上升后趋于稳定，醛类、酯类及其他化合物含量呈下降趋势。整体上，乳脂含量的变化对发酵乳中风味物质含量影响较大，而对风味物质种类影响较小。

上述风味物质中，烃类物质大多来源于原料乳本身，对发酵乳风味的贡献较小。醛类是发酵乳制品中一类重要的风味物质，其风味阈值一般很低[12]，己醛能赋予乳制品新鲜味和青草味，而壬醛具有花香、柑橘及脂肪香气[13]，是巴氏杀菌乳中的主要风味物质[14]。酮类化合物可以由多种途径生成，随着碳链的增长香气更加浓郁，其中2,3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮是发酵乳中的重要风味物质[15]，是奶油味的重要来源[16]，其含量随着乳脂含量的增加先增加后趋于稳定。挥发性有机酸是发酵乳中含量最高的一类风味物质，在发酵乳中主要在脂肪酶的作用下将脂肪水解而形成[17]，具有清爽的口感和乳香味。

2.3.2 发酵乳风味物质组成的主成分分析

图2 发酵乳风味物质组成的主成分分析Fig. 2 Principal component analysis of flavor compounds of fermented milk

为明确乳脂含量变化对发酵乳整体风味特征的影响，利用主成分分析考察挥发性风味物质含量随乳脂含量变化的趋势。由图2可知，主成分1和主成分2的贡献率分别为81.7%和11.6%，可以很好地解释乳脂含量与发酵乳挥发性风味物质含量之间的关系。34 种挥发性风味物质在图中的分布可以分为2 类，一类介于乳脂含量3.7%和3.9%两组样品之间，一类介于乳脂含量4.1%和4.3%两组样品之间，说明随着乳脂含量的增加，一部分风味物质含量随之减小，而另一部分风味物质含量先增加，乳脂含量在4.1%和4.3%之间达到最大值，随后减小。

2.3.3 乳脂含量与风味物质变化相关性分析

Brauss等[3]研究表明，乳脂是一种重要的风味溶剂和风味成分，风味化合物疏水性的不同会影响它们在各相间的分配系数。一般认为，亲水性化合物在食物内部及外部空气中的分布释放与脂肪含量无关，而增加脂肪含量将显著降低顶部空间中疏水性化合物的含量。因此，结合风味化合物的亲水性和亲脂性进一步研究乳脂含量对发酵乳中风味化合物的影响机理。

由表2中的lgP（lgP＞0为亲脂性化合物，lgP＜0为亲水性化合物）可知，34 种物质中有7 种亲水性化合物、27 种亲脂性化合物，说明发酵乳中只有一小部分风味物质是亲水性化合物[18]。

表3 不同乳脂含量发酵乳中亲脂性化合物和亲水性化合物含量Table 3 Content of lipophilic and hydrophilic compounds in fermented milk with different fat contents

由表3可知，随着乳脂含量的增加，亲水性物质含量先增加后减少，占比先增加后趋于稳定，亲脂性物质含量持续降低，占比先降低后趋于稳定，说明乳脂含量的增加会降低顶部空间中亲脂性化合物的含量，同时增加顶部空间中亲水性化合物的含量，这与乳脂对亲脂性化合物的结合有关[7]。亲脂性风味物质在乳脂肪球上的吸附使其释放速率降低，而亲水性化合物不受影响，进而使得挥发性物质在顶空中达到平衡时，顶空气体中亲水性化合物含量增加，而亲脂性化合物含量降低。当乳脂含量较高时，顶空中亲水性化合物含量降低，这可能与乳脂引起的发酵乳结构变化有关。

表4 乳脂含量与亲水性化合物含量的相关性Table4 Correlation between milk fat content and hydrophilic flavor compounds

表5 乳脂含量与亲脂性化合物含量的相关性Table 5 Correlation between milk fat content and lipophilic flavor compounds

为了进一步明确乳脂含量对不同亲水性及亲脂性风味化合物的影响，采用Pearson相关性分析研究乳脂含量和2 种风味化合物之间的关系。由表4～5可知，亲水性风味化合物中γ-丁内酯含量与乳脂含量呈极显著负相关，其余均为正相关，但相关性均不显著，说明乳脂含量对亲水性风味化合物的影响较小。亲脂性风味化合物中，苯乙烯、2-乙基己醇、2-壬酮、己酸和丁酸5 种风味化合物含量与乳脂含量呈正相关，其余均为负相关，并且除己醛、辛酸、癸酸外相关性均较高。整体上，风味化合物的亲脂性越强，其含量与乳脂含量的相关性越显著。同时，乳脂含量对风味化合物含量的影响和风味化合物疏水性强弱的关系并不绝对。

结合乳酸菌在牛乳发酵过程中降解脂质的途径[19-20]及乳脂在发酵过程中的代谢进一步分析可知，对于含量变化与疏水性强弱相关性较小的风味物质，丁酸、己酸、辛酸、癸酸等游离脂肪酸可以通过饱和脂肪酸的降解大量产生[21]。经过β-氧化、水解、脱羧等作用，饱和脂肪酸还可以生成2-壬酮等甲基酮类物质，而不饱和脂肪酸在自由基的存在下被氧化形成氢过氧化物，迅速分解可以形成己醛或不饱和醛，进一步降解可以得到醇类、酸类物质[22]，同时不饱和脂肪酸的β-氧化能够形成4-羟基酸或5-羟基酸[23]，在发酵乳中这些环酸容易环化得到γ-丁内酯等γ-内酯或δ-内酯类物质。因此，在不同乳脂含量发酵乳中，乳脂相关代谢产物的变化不完全受其亲水性及亲脂性的影响。随着乳脂含量的增加，除了γ-丁内酯，其代谢产物的含量也随之增加，但是发酵过程中脂肪代谢能够产生的风味物质有限，而乳脂含量越高，其对亲脂性风味物质的吸附越强，2-壬酮、己醛、丁酸、己酸等乳脂代谢产物含量降低。而随着乳脂含量增加，γ-丁内酯含量的直接降低可能与乳脂含量增加引起的不饱和脂肪酸代谢途径变化有关。

3 结论

改变牛乳中的乳脂含量并对其进行发酵，结果表明：发酵pH值曲线显示，乳脂含量的变化对乳酸菌的产酸没有影响；流变学和质构特性测定结果显示，随着乳脂含量的增加，发酵乳G’和G”降低，硬度和内聚性无明显变化，而胶着性显著增加（P＜0.05）；GC-MS分析共检出7 种亲水性风味化合物和27 种亲脂性风味化合物，随着乳脂含量的增加，发酵乳的风味物质种类无明显差异，但含量有明显变化，且变化趋势不一；主成分分析结合相关性分析结果显示，风味物质含量与其自身的疏水性强弱及来源有关，除γ-丁内酯外，2-壬酮、己醛等与乳脂相关的代谢产物含量整体上先增加后减少，与乳脂降解无关的风味物质中，亲水性风味化合物含量先增加后减少，而亲脂性风味化合物含量降低。