绵羊乳与其他乳种营养成分及乳清蛋白组分差异性分析

吴仪凡，葛武鹏,*，刘凯茹，宋宇轩，赵丽丽，张文博，王雨馨，梁秀珍

（1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西省羊乳产品质量监督检验中心，陕西 富平 711700；3.陕西中检检测技术有限公司，陕西西安710068；4.陕西飞天乳业有限公司，陕西宝鸡721100）

绵羊乳口感细腻，富含蛋白质、脂肪、乳糖、矿物质和维生素等营养成分[1-2]。绵羊乳的总乳固体、脂肪、蛋白质和乳糖含量均高于山羊乳，有“乳中新贵”之称[3-5]。湖羊是我国著名的绵羊品种之一，东佛里生羊是世界著名的乳肉兼用型绵羊品种[6-8]。但目前关于湖羊和东佛里生羊乳营养成分及其乳清蛋白组成的研究较少，绵羊乳的开发利用仍处于初级阶段。研究不同品种、不同泌乳周期绵羊乳的宏量营养素构成与含量，能够为合理利用资源、开发绵羊乳加工产品提供参考依据。

乳制品作为优质动物性蛋白的主要来源，其包含的各类蛋白均具有一定的生物活性和功能[9-11]。人乳中含量最为丰富的是乳清蛋白，其易于消化吸收，对婴幼儿的生长发育至关重要。乳清蛋白主要包含α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA）、β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）、血清白蛋白（serum albumin，SA）、免疫球蛋白（immunoglobulin，IgG）和乳铁蛋白（lactoferrin，LF）等[12-14]，不同品种及不同泌乳阶段绵羊乳营养特性及乳清蛋白组成的相关研究鲜有报道。本研究重点解析绵羊乳乳清蛋白组成，既有助于区分绵羊乳与山羊乳和牛乳，又能为绵羊乳功能性产品的开发利用提供参考。以山羊乳、牛乳、人乳为对照，分析比较湖羊、东佛里生羊、东湖杂交一代羊乳及不同泌乳时间绵羊乳的基本营养成分和乳清蛋白组成差异，重点比较绵羊乳与山羊乳、牛乳、人乳乳清蛋白组分的差异，筛选差异蛋白标志物，为绵羊乳质量监控及绵羊乳掺假鉴别提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品来源

绵羊乳采自甘肃省金昌市，包含湖羊、东佛里生羊、东湖杂交一代羊（简称杂一代）3 个品种，采集湖羊初乳、湖羊乳（30 d）、东佛里生羊初乳、东佛里生羊乳（15、90 d）、杂一代羊乳（15、30 d）；山羊乳采自西北农林科技大学克隆羊基地；人乳采自健康女性志愿者；牛乳采自西北农林科技大学畜牧教学试验基地奶牛场。山羊乳、人乳、牛乳均为常乳。收集乳样后，用干冰迅速冷却，利用4 ℃冰盒运至实验室，于-80 ℃冻藏备用。

1.1.2 试剂

DM131彩虹180广谱蛋白Marker 北京全式金生物技术有限公司；BCA蛋白定量试剂盒西安赫特生物科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris）、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺、冰醋酸上海展云化工有限公司；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）德州同威新材料科技有限公司；过硫酸铵上海埃彼化学试剂有限公司；丙烯酰胺上海惠诚生物科技有限公司；甘氨酸、考马斯亮蓝R250上海源叶生物科技有限公司；N,N-亚甲基丙烯酰胺德州曼巴商贸有限公司；甲醇天津康科德科技有限公司；溴酚蓝沈阳从科化工有限公司；β-巯基乙醇北京百奥莱博科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Milko Scan FT120多功能乳品分析仪丹麦Foss公司；Mini P-4伯乐小型垂直电泳槽北京凯元信瑞有限公司；VictorX3多功能酶标仪美国PE公司；ChemiDoc MP化学发光凝胶成像系统美国Bio-Rad公司；JY600C电泳仪北京君意东方电泳有限公司；HH-2电热恒温水浴锅北京科伟永兴仪器有限公司；ZONKIA HC-3018高速离心机 安徽中科中佳有限公司；SHZ-82恒温振荡器常州国华电器有限公司；PB-10 pH计德国赛多里斯科学仪器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式真空泵郑州长城科工贸有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳样营养成分测定

取30 mL乳样，用多功能乳品分析仪测定其基本营养成分（总乳固体、非脂乳固体、脂肪、乳糖、总蛋白、酪蛋白）含量，每个样品测定3 次。

1.3.2 乳清蛋白分离

取40 mL乳样，4 ℃、5 000 r/min条件下离心30 min，分离上层脂肪，于脂肪层中加入3 mL去离子水，混匀后再次离心10 min，去除上层脂肪，将下层乳液和第1次离心收集的下层乳液混合，即为脱脂乳。

乳清蛋白分离：将收集的脱脂乳用1 mol/L HCl调节pH值至酪蛋白等电点（绵羊乳、山羊乳等电点均为4.1，牛乳等电点4.6，人乳等电点4.3），室温静置40 min，在4 ℃、5 000 r/min条件下离心10 min，沉淀酪蛋白，收集上清液；将3 mL去离子水加入酪蛋白层，再次离心10 min，将上清液与第1次离心收集的上清液混合，即为乳清蛋白溶液。

乳清蛋白质量浓度测定：利用BCA蛋白定量试剂盒测定乳清蛋白溶液中乳清蛋白的质量浓度。将每种乳样的乳清蛋白质量浓度均调整为4 mg/mL。

1.3.3 电泳分析

1.3.3.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）样品制备

将乳清蛋白溶液与等体积的2×SDS上样缓冲液（含去离子水8.0 mL、0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）2.0 mL、丙三醇1.6 mL、10 g/100 mL SDS 3.2 mL、10 mg/mL溴酚蓝0.4 mL、β-巯基乙醇75 μL）混合，沸水浴5 min，冷却至室温，再在5 000 r/min条件下离心10 min，收集上清液用于SDS-PAGE分析。

1.3.3.2 Native-PAGE样品制备

将乳清蛋白溶液与等体积的2×非变性上样缓冲液（含去离子水5.5 mL、0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）1.25 mL、丙三醇3.0 mL、10 mg/mL溴酚蓝0.2 mL）混合，然后在4 ℃、5 000 r/min条件下离心10 min，收集上清液用于Native-PAGE分析。

1.3.3.3 电泳条件

SDS-PAGE和Native-PAGE的浓缩胶质量分数均为4%，分离胶质量分数为12.5%，上样量为15 μL，设定浓缩胶电流15 mA，分离胶电流30 mA。当溴酚蓝指示剂距分离胶底部1 cm处时停止电泳。其中，SDS-PAGE在室温条件下进行，Native-PAGE在0～4 ℃条件下进行，防止蛋白质在电泳过程中变性。电泳结束后，将凝胶用考马斯亮蓝染液（含45%甲醇、10%醋酸、0.1%考马斯亮蓝R250）染色1 h，用脱色液（含25%甲醇、10%醋酸）脱色至蛋白条带清晰可见，用蒸馏水浸泡1 h后，用凝胶成像系统成像并拍照[15]。利用Image La软件对蛋白条带进行分析。

1.4 数据处理

利用Excel、SPSS 18.0软件对数据进行汇总及单因素方差分析、Duncan’s多重比较，结果以平均值±标准差表示，P＜0.05为显著水平，P＜0.01为极显著水平。

2 结果与分析

2.1 绵羊乳与山羊乳、牛乳及人乳营养成分差异分析

由表1可知：绵羊乳总乳固体含量极显著高于山羊乳、牛乳和人乳（P＜0.01）；东佛里生羊初乳、杂一代羊乳、湖羊初乳非脂乳固体含量极显著高于其他乳（P＜0.01）；绵羊乳脂肪含量显著高于山羊乳、牛乳和人乳（P＜0.05），其中湖羊初乳脂肪含量最高；与其他品种乳相比，人乳的乳糖含量最高，这一结果与李龙柱[16]、陈天鹏[17]等的报道一致，绵羊乳乳糖含量与山羊乳、牛乳无显著差异；东佛里生羊乳（15、90 d）总蛋白、酪蛋白含量与山羊乳无显著差异，但羊乳中总蛋白、酪蛋白含量极显著高于牛乳和人乳（P＜0.01）。由此可知，不同品种的绵羊乳与山羊乳、牛乳及人乳的营养成分存在显著性差异。

表1 羊乳与山牛乳及人乳基本营养成分差异分析Table 1tritional components of sheep, goat, cow and human milk

湖羊初乳的总乳固体、非脂乳固体、脂肪、乳糖、总蛋白、酪蛋白含量显著高于湖羊常乳（30 d）（P＜0.05）；东佛里生羊初乳的总乳固体、非脂乳固体、脂肪、总蛋白、酪蛋白含量显著高于东佛里生羊常乳（15、90 d）（P＜0.05），乳糖含量显著低于东佛里生羊常乳（P＜0.05），这一结果与买买提伊明·巴拉提[2]、娜日娜[18]、马友记[19]等研究多浪羊、小尾寒羊和甘肃肉绵羊初乳和常乳变化的结果一致。随泌乳时间增加，东佛里生羊乳、杂一代羊乳的总乳固体、非脂乳固体、脂肪、总蛋白、酪蛋白含量均呈现下降趋势，东佛里生羊乳糖含量呈增加趋势。由此可知，不同品种绵羊乳的营养成分随泌乳周期的变化而变化。

2.2 绵羊乳与山羊乳、牛乳、人乳乳清蛋白组成差异分析

2.2.1 SDS-PAGE分析结果

由图1可知，绵羊乳、山羊乳、牛乳及人乳乳清蛋白主要由α-LA、β-LG、SA、IgG和LF 5 种蛋白质组成，不同乳种乳清蛋白组成存在较大差异。

α-LA是必需氨基酸和支链氨基酸的极好来源，也是唯一能与金属元素和钙元素结合的乳清蛋白成分，绵羊乳中的α-LA在氨基酸结构比例和功能特性上与人乳均非常相似[20]，α-LA的色氨酸及半胱氨酸含量很高，而高含量的色氨酸和半胱氨酸能够激发免疫系统活性，对于婴儿免疫力的提高及睡眠质量的改善有重要作用[21]。东佛里羊乳和杂一代羊乳中α-LA含量均明显高于湖羊乳、山羊乳、人乳及牛乳。β-LG可溶性强，支链氨基酸含量丰富，是乳清蛋白中半胱氨酸和甲硫氨酸的主要来源，β-LG具备最佳的氨基酸比例，能够对脂溶性营养素进行预结合，从而促进人体的吸收[22]。绵羊乳、山羊乳和牛乳中β-LG含量丰富。SA能够与代谢物、维生素及金属离子等结合，在血液循环中可作为许多内源性和外源性物质的存储和转运载体[23]，东佛里生羊乳（15 d）及人乳中的SA含量较高。IgG是乳清蛋白中热敏感性最强的一种蛋白质，IgG是因外源大分子抗原刺激而产生的一种抗体，在巯基乙醇和SDS的变性作用下IgG裂解为IgG-H（重链）和IgG-L（轻链）[24]。绵羊乳和山羊乳的IgG-H含量明显高于牛乳和人乳，含量由高到低依次为湖羊初乳、山羊乳、湖羊乳（30 d）、人乳、牛乳。LF有抗菌性、抗病毒性，具有参与体内铁代谢、调节机体免疫等作用[25]。人乳中LF含量最高，其次为山羊乳，绵羊乳中LF含量明显低于人乳和山羊乳，但明显高于牛乳，不同品种和泌乳阶段的绵羊乳LF含量也存在明显差异。

图1 绵羊乳、山羊乳、牛乳及人乳乳清蛋白的SDS-PAGE图Fig. 1SDS-PAGE of whey proteins in sheep, goat, cow and human milk

综上可知，区分绵羊乳和人乳的标志性蛋白为β-LG和LF，区分绵羊乳和山羊乳的标志性蛋白为α-LA，区分绵羊乳和牛乳的标志性蛋白为IgG-H。

2.2.2 Native-PAGE分析结果

由图2可知，绵羊乳、山羊乳、人乳、牛乳乳清蛋白在Native-PAGE中呈现明显差异。绵羊乳乳清蛋白主要有2 个明显的蛋白条带，分别为条带1、2；山羊乳乳清蛋白主要有3 个蛋白条带，分别为条带1、2、3，绵羊乳与山羊乳之间的差异性蛋白条带为条带3；人乳乳清蛋白主要有4 个蛋白条带，牛乳乳清蛋白也主要有4 个蛋白条带，除了条带1，人乳中的其他乳清蛋白组分分子质量均小于牛乳乳清蛋白。宋宏新等[26]已通过Native-PAGE很好地区分了牛乳与山羊乳，本研究通过对绵羊乳、山羊乳、牛乳和人乳乳清蛋白进行Native-PAGE分析，发现这4 种乳源中乳清蛋白组分之间均存在差异。因此，Native-PAGE也可作为鉴别绵羊乳、山羊乳、牛乳掺假的有效方法。

图2 绵羊乳、山羊乳、牛乳及人乳乳清蛋白的Native-PAGE图Fig. 2 Native-PAGE of whey proteins in sheep, goat, cow and human milk

3 结论

以山羊乳、牛乳和人乳为对照，对不同泌乳阶段的湖羊乳、东佛里生羊乳、东湖杂交一代羊乳的营养成分进行分析，利用SDS-PAGE和Native-PAGE研究乳样的乳清蛋白组成差异。结果表明：不同品种的绵羊乳与山羊乳、牛乳、人乳的蛋白质、脂肪、总乳固体含量之间存在显著差异（P＜0.05）；不同品种绵羊乳的部分营养指标随泌乳阶段的变化具有一定趋势性规律；通过SDS-PAGE发现，绵羊乳和人乳的LF、β-LG含量存在差异，绵羊乳和山羊乳的α-LA含量存在差异，绵羊乳和牛乳的IgG-H含量存在差异；通过Native-PAGE发现，绵羊乳与山羊乳乳清蛋白之间存在1 条差异性条带，绵羊乳与人乳、牛乳乳清蛋白之间存在3 条差异性条带，这些差异蛋白可作为鉴别绵羊乳、山羊乳、牛乳掺假的标志性蛋白。