冲调温度对婴儿配方乳粉中益生菌存活率的影响

贾宏信，揭良，罗妮

（1.光明乳业股份有限公司乳业研究院，上海乳业生物工程技术研究中心，乳业生物技术国家重点实验室，上海200436；2.上海商学院酒店管理学院，上海200235）

婴儿配方乳粉是母乳的最佳替代品，能最大限度为婴儿提供生长发育所需的营养。但是婴儿配方乳粉通常不是无菌的，其本身可能含有多种致病菌[1-2]，在可能存在的致病菌中，克罗诺杆菌（又称阪崎肠杆菌）属危害最大，它可能是新生儿、早产儿及免疫力受损婴儿发生败血症和脑膜炎的病原体，并且一旦婴儿感染，致死率高达80%[1,3]。考虑到降低克罗诺杆菌和沙门氏菌对于婴儿健康的危害，2006年联合国粮农组织（United Nations Food Agriculture Organization，FAO）和世界卫生组织（World Health Organization，WHO）建议对于感染风险较高的婴儿配方乳粉的冲调温度应不低于70 ℃，并在乳粉充分溶解后立即用自来水冲凉奶瓶，或者立即将奶瓶放在冷水或冰水中冷却[4]。随着婴儿配方乳粉加工技术水平的不断提高，克罗诺杆菌的危害已经得到严格控制，例如，我国婴儿配方乳粉限定每批取样3 份，每份取样100 g，克罗诺杆菌的检出结果均为阴性[5]。另外，益生菌被证明有益于婴儿健康[6]，目前已在婴儿配方食品中广泛应用[7-8]，如果依然选用70 ℃以上的冲调温度不但会造成配方乳粉内热敏物质（如乳铁蛋白、VC、VD等）的损失，也会严重影响益生菌在配方乳粉冲调液内的存活率，进而影响益生菌的有益作用。本研究就不同冲调温度及冲调方式对婴儿配方乳粉冲调液内益生菌存活率的影响进行研究，以期为含益生菌婴儿配方乳粉冲调方式的选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

4 种不同品牌婴儿配方乳粉 市售。

MRS固体培养基、平板计数固体培养基、结晶紫中性红胆盐固体培养基和Baird-Parker培养基 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；氯化钠 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

A35厌氧培养箱 英国Don Whitley Scientific公司；HPP110恒温恒湿培养箱 德国Memmert公司；TE612-L电子天平 德国Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 婴儿配方乳粉中益生菌计数

参考贾宏信等[9]的方法，并稍作修改。称取婴儿配方乳粉25 g，加入到225 mL 0.85 g/100 mL的生理盐水中（已灭菌），混匀；取1 mL上述冲调液用生理盐水进行10 倍梯度稀释，最后取3 个适宜的稀释梯度（根据各乳粉标示值确定）进行实验。MRS平板倾注前进行121 ℃、15 min灭菌，待冷却至45 ℃左右时再进行倾注。每个样品平行设置3 个平板，结果取平均值，即为各婴儿配方乳粉中益生菌数的实际检测值。

1.3.2 不同冲调方式婴儿配方乳粉中益生菌计数

冲调方式1：温水直接冲调，称取不同品牌的婴儿配方乳粉，依照该乳粉的标准冲调法，将其加入到不同温度（40、50、60、70 ℃）温水中，混匀（2～5 min），然后用自来水冲冷至35 ℃左右。冲调方式2：温/凉水两步冲调，称取不同品牌的婴儿配方乳粉，依照该乳粉的标准冲调法，将其加入到冲调所需体积一半的温水（40、50、60、70 ℃）中，混匀（2～5 min），然后再加入等体积的常温水（开水冷却至21～25 ℃），混匀，温度较高的用自来水冲冷至35 ℃左右。待检测。

取冷却的上述冲调液各1 mL，用0.85 g/100 mL的生理盐水进行10 倍梯度稀释，取3 个适宜的稀释梯度进行MRS培养基倾注实验，方法同1.3.1节。

益生菌存活率按下式计算。

式中：N、N0分别为冲调后和乳粉中益生菌数的实测值/（CFU/g）。

1.3.3 婴儿配方乳粉冲调液中微生物的跟踪检测

取不同品牌婴儿配方乳粉，按温水直接冲调和温/凉水两步冲调法冲调（冲调所用温水温度50 ℃），但冲调浓度依据GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[10]、GB 4789.3—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》[11]、GB 4789.10—2016《食品卫生微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》[12]和GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验 乳酸菌检验》[13]稀释要求，并10 倍梯度稀释，检测婴儿配方乳粉冲调液的菌落总数、大肠菌群数、金黄色葡萄球菌和双歧杆菌数量。监测冲调液（5±1） ℃放置24 h的微生物数量变化，分别于0、8、16、24 h检测菌落总数、大肠菌群数、金黄色葡萄球菌和双歧杆菌的数量。

1.3.4 培养与计数

待倾注后的平板培养基冷却凝固后，用于益生菌计数的平板放置在厌氧箱内37 ℃厌氧培养48 h后计数；用于菌落总数、大肠菌群和金黄色葡萄球菌计数的平板放置在37 ℃培养箱内培养48 h后计数；双歧杆菌的有效计数在平板菌落数30～300 CFU/平板时进行。

1.4 数据处理

采用SPSS17.0统计软件对数据进行单因素方差分析，显著水平P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 婴儿配方乳粉中益生菌水平

表1 不同品牌婴儿配方乳粉中益生菌的实际检测值Table 1Claimed versus measured counts of probiotics in different brands of infant formula

由表1可知，市售4 款婴儿配方乳粉中活性益生菌的实际检测值均在1.0×107CFU/g以上，均满足GB 10765—2010《食品安全国家标准 婴儿配方食品》的规定（活性益生菌数量≥106CFU/g）。2001年，FAO和WHO将益生菌定义为“活的微生物，摄入适量对宿主健康产生有益作用的活菌”[14]，从该定义可知，“活”对于益生菌而言很重要。另有临床研究证明，每200 mL乳粉冲调液中动物双歧杆菌Bb-12数量达到107CFU/g可以有效提高15～31 个月幼儿的免疫力[15]。俞漪等[16]研究表明，2014年市售中国婴幼儿配方乳粉中益生菌活菌数多集中在1×106～1×107CFU/g，而益生菌活菌数高于1×107CFU/g的婴幼儿配方乳粉仅占15%，并且还有10%的乳粉益生菌活菌数小于1×105CFU/g。本研究中4 款市售婴儿配方乳粉中益生菌活菌数均高于1.0×107CFU/g可能与所选品牌为市场主流品牌有关，也可能与2015年中国婴幼儿配方乳粉注册制的实施有关。

2.2 不同冲调方式婴儿配方乳粉中益生菌的存活率

表2 不同冲调方式婴儿配方乳粉中益生菌的存活率Table 2 Survival rates of probiotics in different brands of infant formula reconstituted by different methods%

由表2可知，婴儿配方乳粉的冲调温度对益生菌的存活率影响很大，冲调所用温水温度越高，益生菌的存活率越低。冲调所用温水温度为40 ℃时，益生菌的平均存活率分别为94.89%（温水直接冲调）和98.31%（温/凉水两步冲调），但是冲调所用温水温度达到70 ℃时，益生菌的存活率分别仅为1.49%和15.81%。另外，温水直接冲调时，在相同冲调温度下，不同品牌乳粉的益生菌存活率不尽相同，特别是在60、70 ℃冲调温度下，各品牌乳粉的存活率相差1 倍以上，甚至达到几十倍，说明不同品牌乳粉所含益生菌的耐热性不同。张宜凤等[17]研究耐热乳酸菌的耐热性，发现即使是耐热性乳酸菌，其D值（特定温度下，乳酸菌存活量下降1 个对数单位（90%）所需的时间）在60 ℃时多数仅为2 min左右，说明大部分乳酸菌在温度高于60 ℃的情况下很快会热致死。因此，益生菌在较高温度的水中所处时间越短越利于其存活，这也解释了本研究中60、70 ℃冲调温度下益生菌存活率不高的原因。

在相同冲调温水温度下，温/凉水两步冲调婴儿配方乳粉中益生菌的平均存活率均高于温水直接冲调，说明常温自来水冲冷对于益生菌的保护效果远低于直接加入常温水。如果不考虑冲调方式，含益生菌的婴儿配方乳粉冲调所用温水温度可以控制在40～50 ℃，这样有利于乳粉内益生菌的存活。一项针对中国居民家庭婴幼儿配方乳粉消费习惯的调查[3]显示，目前我国居民家庭冲调配方乳粉时有55.73%居民选择40～50 ℃的温水，24.36%居民选择60 ℃的水，18.48%居民选择70～80 ℃的水，说明多数消费者已经在使用有利于益生菌存活的冲调温度。另外，婴儿配方乳粉冲调温度为40～50 ℃时，乳粉的感官评分更高，维生素损失更少，所含不饱和脂肪酸更稳定[18-19]。因此，对于含益生菌的婴儿配方乳粉，建议冲调所用温水温度为40～50 ℃，冲调方式可以任选；如果冲调所用温水温度为60～70 ℃，建议冲调方式为温/凉水两步冲调，这样有利于婴儿配方乳粉中益生菌的存活。

2.3 婴儿配方乳粉冲调液存放24 h期间的微生物数量变化

根据FAO和WHO的建议，对于大批量冲调的婴儿配方乳粉，冲调液应装于消毒洁净容器内，冰箱冷藏时间不宜超过24 h，超过24 h应丢弃，不能再给婴儿食用[4]。欧洲儿科胃肠病学、肝病学和营养协会也提出了类似建议，冲调好的婴儿配方乳4 ℃冷藏时间不宜超过30 h[20]。基于以上建议，本研究跟踪检测2 种冲调方式婴儿配方乳粉冲调液5 ℃条件下贮藏24 h期间的菌落总数、大肠菌群数、金黄色葡萄球菌及双歧杆菌的数量变化。

表3 婴儿配方乳粉冲调液5 ℃条件贮藏24 h期间的微生物数量变化Table 3Microbiological changes in reconstituted infant formula during 24 h storage at 5 ℃

由表3可知，4 个品牌的婴儿配方乳粉冲调后，菌落总数（均小于200 CFU/g）、大肠菌群（均为阴性）和金黄色葡萄球菌（均为阴性）检测结果均满足GB 10765—2010《食品安全国家标准 婴儿配方食品》的要求，说明市售4 款婴儿配方乳粉的微生物控制均达到极佳状态。另外，同种冲调方式下，同一品牌乳粉冲调液5 ℃冷藏24 h期间的双歧杆菌活菌数及菌落总数均无显著差异（P≥0.05）。上述结果表明，5 ℃冷藏完全能满足含益生菌婴儿配方乳粉冲调液的保存需求。

3 结论

冲调所用温水温度越高，婴儿配方乳粉中益生菌的存活率越低，冲调所用温水温度达到70 ℃时，温水直接冲调的婴儿配方乳粉中益生菌存活率为1.49%，温/凉水两步冲调乳粉中为15.81%，说明70 ℃的冲调温度不适用于含益生菌的婴儿配方乳粉。温/凉水两步冲调有利于乳粉中益生菌的存活，选择温/凉水两步冲调，冲调所用温水温度上升至60 ℃也能保证益生菌的存活率高于50%。如不考虑冲调方式，40～50 ℃是含益生菌乳粉的适宜冲调温度。未经食用的婴幼儿配方乳粉冲调液应于5 ℃冷藏，以保证冲调液中益生菌的存活，并控制冲调液中其他微生物的增殖。