miR-195 通过靶向调控SerpinA3促进胃癌细胞增殖、转移及侵袭的实验研究

罗文 李群芳 严超 萧赪

湖南环境生物职业技术学院内科教研室（湖南衡阳421001）

胃癌（gastric cancer）是人类常见恶性肿瘤，很多胃癌发现时已经到了晚期，预后不良。microRNAs（miRNAs）是长度22 nt 的内源性非编码RNA，与靶基因相互作用后调控转录及转录后基因表达。miRNA 先被RNA 聚合酶Ⅱ转录为1 000 nt 的初始转录本，再经过Drosha 酶剪切作用后形成长70 nt 的miRNA 前体，最后经Dicer 酶作用形成成熟的miRNA。miR-195 通过调控多种基因达到抑癌效果［1］。有报道称，miR-195 通过靶向bcl-2 基因抑制喉癌细胞Hep-2 增殖，加速凋亡［2］。miR-195在肺癌组织中低表达，与临床病理参数相关［3］。丝氨酸蛋白酶抑制因子A 类3（serpin peptidase inhibitor clade A member 3，SerpinA3）主要存在于真核生物细胞，其表达与多种疾病的发生发展有关［4］。然而，关于miR-19、SerpinA3 与胃癌的关系尚不明确。本研究探讨了miR-195、SerpinA3 与胃癌的关系，旨在研究胃癌癌变机制，为胃癌的诊治、预后提供新思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、细胞株及仪器 人胃癌MGC803及NCI-N87 细胞系（上海生命科学研究所）。miR-195引物序列、miR-195 mimics、miR-NC 对照质粒（上海生命科学研究所）；含野生型和突变型SerpinA3序列的荧光素酶报告基因质粒（上海生工生物公司）；SerpinA3 一抗和二抗（Sigma 公司，美国）；RNA 提取试剂盒，转染试剂盒（武汉博士德生物公司）；AnnexinV-FITC，MTT 试剂盒（武汉博士德生物公司）；荧光素酶检测试剂盒（BioVision 公司，美国）；Transwell 小室、PCR 试剂盒（Sigma 公司，美国）；酶标仪（上海仪电分析仪器有限公司）；ABI 7900PCR 扩增仪（上海仪电分析仪器有限公司）；流式细胞计数仪CytoFLEX LX（上海仪电分析仪器有限公司）。

1.2 细胞转染、分组 使用RPMI-1640 培养基，37 ℃，5%CO2条件下传代培养，定期换液。根据转染不同分为：miR-NC 组（空质粒），miR-195-mimics组（模拟序列）。转染后细胞继续孵育48 h。

1.3 RT-PCR检测miR-195 mRNA表达 利用Trizol试剂提取各组细胞总RNA，测定RNA 浓度，将合格的总RNA 转录成cDNA，然后进行PCR 扩增。PCR 反应条件：95 ℃预变性15 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，74 ℃延伸30 s，共，40 个循环。实时荧光定量PCR 结果采用2-ΔCt表示。引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Sequence of primers

1.4 MTT 实验 将各组细胞接种于96 孔板中，细胞浓度调整为5×103个/孔，培养24 h，分别于培养后1、2、3、4、5 d 每孔加入20 μL MTT 溶液，继续培养4 h 后酶标仪测量OD值。细胞生长抑制率（IC）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。

1.5 流式细胞术 各组细胞胰酶消化，离心，PBS洗涤3 遍，离心，PBS 重悬，室温培养1 h，75%乙醇固定20 min，PBS洗涤3遍，加入10 μL PI避光条件下4 ℃孵育1 h。流式细胞仪测定Ex = 488 nm 处的荧光强度。

1.6 Transwell 小室实验 用预冷不含血清的培养基稀释Matrigel 基质胶，铺于24 孔板上室内，紫外线杀菌，使用前加入少量无血清的培养基置孵育2 h 水化。接种细胞于24 孔板上室内，密度为6 × 104个/孔，下室加入RPMI-1640，孵育12 h，洗涤死亡悬浮细胞。4%多聚甲醛固定10 min，0.5%结晶紫染色10 min。95%乙醇4 ℃条件下下洗涤6 h，光学显微镜下评估5 个视野细胞侵袭情况，取平均值。

1.7 细胞划痕实验 在孔板背面用marker 笔划两条直线，接种细胞，无菌移液器枪头在细胞区域沿着划痕划“-”字，显微镜下分析划痕区细胞数量。

1.8 Western Blot 检测SerpinA3 蛋白量表达 去除培养基，PBS 洗涤细胞，裂解液裂解细胞，冰浴30 min，40 ℃1 500 r/min离心5 min，吸去上层液体，超声波破核，再次离心，取上层液体10 μL 待测。配胶，上样，电泳，转膜，切膜，封闭液封闭1 h，逐次鼠抗人SerpinA3 多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗。Bio-Rad 成像仪曝光成像，Image Lab Software 测定光密度。

1.9 荧光素酶实验验证miR-195 与SerpinA3 的靶向作用关系 按照试剂盒步骤将SerpinA3 野生型或突变型的荧光素酶报告基因质粒载体单独转入细胞，培养48 h 后去除培养液。PBS 洗涤3 遍，加入细胞裂解液。4 ℃振荡10 min，40 ℃1 000 r/min离心3 min，取上清进行发光测定。

1.10 统计学方法 本实验数据使用SPSS11.0软件分析，计量资料（）表示，组间比较采用t检验，计数资料使用（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用Pearson 相关分析SerpinA3 蛋白及miRNA-195 表 达的相关性。P＜0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组miR-195 表达分析 miR-195-mimics 组细胞miR-195 水平高于miR-NC 组（P＜0.05）。见图1。

图1 各组细胞miR-195 mRNA 水平Fig.1 Cell miR-195 mRNA levels in each group

2.2 miR-195 过表达对细胞增殖、凋亡的影响miR-195 mimics 组第1、2、3、4 天细胞活力低于miR-NC 组（P＜0.05）。见图2A。

miR-195 mimics 组G1 细胞高于miR-NC 组，G2期、S 期细胞低于miR-NC 组，G2/S 期细胞比值低于miR-NC 组（P＜0.05）。见图2。

2.3 miR-195 过表达对细胞迁移、侵袭能力的影响 miR-195 mimics 组细胞划痕距离大于miR-NC组（P＜0.05）。见图3A。miR-195 mimics 组细胞侵袭数低于miR-NC 组（P＜0.05）。见图3B。

2.4 过表达miR-195 对SerpinA3 蛋白的影响miR-195 mimics组细胞SerpinA3蛋白水平低于miRNC 组（P＜0.05），见图4。Spearman 相关分析显示，转染miR-195 mimics前后细胞中miR-195 mRNA水平与SerpinA3蛋白含量负相关（r=-0.464，P＜0.01）。

图2 miR-195 过表达对细胞增值、凋亡的影响Fig.2 Effect of miR-195 overexpression on cell proliferation and apoptosis

2.5 miR-195 直接靶向作用于SerpinA3 荧光素酶实验进一步验证结果显示，转染野生型和突变型SerpinA3 序列质粒的细胞中荧光素酶活性无明显差异（P＞0.05）；转染miR-195 mimic 和野生型SerpinA3 序列质粒与单独转染野生型SerpinA3 序列质粒比较，荧光素酶活性明显下降（P＜0.01）；转染miR-195 mimic 和突变型SerpinA3 序列质粒与单独转染突变型SerpinA3 序列质粒相比，荧光素酶活性无明显变化（P＞0.05）。见图5。上述结果表明miR-195 直接靶向作用于SerpinA3。

3 讨论

图3 miR-195 对细胞迁移、侵袭能力的影响Fig.3 Effect of miR-195 overexpression on cell migration and invasion

图4 过表达miR-195 对SerpinA3 蛋白的影响Fig.4 The Effect of Overexpression of miR-195 on SerpinA3 Protein

研究［5-6］表明，miRNAs 在肿瘤的发生发展中起到至关重要的作用。miR-195 基因位于17 号常染色体长臂［7］。研究［8］表明miR-195 乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肝癌等肿瘤组织中低表达，与肿瘤的侵袭、转移有关。另外学者研究提示miR-195 在非小细胞肺癌组织中低表达，可以抑制细胞的迁移、转移［9］。另外学者研究表明［10］，miR-195 在胃癌组织中同样低表达，与淋巴结是否转移有关。笔者研究表明，转染miR-195 后的胃癌细胞系增殖、侵袭及迁移能力降低。转染miR-195 后的胃癌细胞处于G1/G2 期增多，S 期降低，提示miR-195的过表达可使胃癌细胞停留于G1/G2 期。

图5 miR-195 与SerpinA3 的靶向关系Fig.5 Target relationship between miR-195 and SerpinA3

丝氨酸蛋白酶抑制蛋白（Serpin）主要存在于真核生物细胞，可以抑制朊酶活性，而朊酶的主要作用是直接破坏细胞或组织的基底膜以及细胞外膜的结构和多种功能蛋白的表达，进而可表现促进癌细胞的浸润与转移的生物学效应，如基质金属蛋白酶、组织蛋白酶在直肠癌细胞的侵袭和转移行为中发挥不可替代的作用。SerpinA3 功能复杂，与多种疾病密切相关［11-13］。研究［14-15］表明，SerpinA3 在结肠癌组织高表达，与肿瘤临床病理特征，如转移、侵袭及转移登密切相关。另外研究表明［15］，黑色素瘤组织中SerpinA3 高表达，且与肿瘤临床病理特征，如转移、侵袭及转移登密切相关。本研究结果表明，转染miR-195 mimics 后胃癌细胞中SerpinA3 蛋白水平降低，相关性分析表明，两者呈负相关。荧光素酶实验进一步验证结果显示，miR-195 直接靶向作用于SerpinA3。分析原因可能与miR-195 下调SerpinA3 表达，进而调控胃癌细胞生物学行为，但机制尚需要进一步研究证实。

本次研究还存在不足之处，如未对其他靶基因与相关通路研究，今后对相关通路分析、验证，希望为胃癌的诊治提供思路。

总之，miR-195 可抑制胃癌恶性行为，其机制与下调SerpinA3 有关，为治疗胃癌的诊治提供新思路。