鹅星状病毒LAMP快速检测方法的建立与应用

张玉霞，杨金兴，孟 凯，蔡李萌，袁小远*，王友令*

(1.山东省农业科学院家禽研究所，山东济南250100；2.青岛农业大学动物医学院，山东青岛266109)

2017 年，我国暴发了一种主要引起雏鹅痛风症状的传染病。该病可导致5 日龄～20 日龄雏鹅发生腹泻、跛行或瘫痪，剖检可见内脏器官和关节有大量的尿酸盐沉积，给我国的养鹅业造成了严重经济损失。多位学者研究初步证实鹅星状病毒(Astrovirus，AstV)是该次疫病的主要病原体[1-2]。鹅AstV属于星状病毒科星状病毒属，基因组分析显示：该次分离的病毒株与已发表的火鸡和鸭感染的AstV株明显不同，属于新的基因型[3-4]。目前，实验室检测该病毒的方法主要有RT-PCR 和荧光定量PCR 方法，这些检测方法需借助昂贵的仪器、成本较高，不适用于基层应用[5-6]。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新型的核酸扩增方法，其反应过程始终维持在恒定的温度下进行。和其它传统的检测方法，如病毒分离鉴定、ELISA、PCR等相比，具有操作简便、高效快速、不需要昂贵仪器的特点，已广泛用于多种动植物的病原微生物检测中[7-8]。本研究针对鹅AstV 的ORF1b 基因序列，设计特异性LAMP 引物，建立了该病毒的快速特异LAMP 检测方法。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 鹅AstV SD17 株、鹅细小病毒GPV-E 株、鹅副黏病毒YG 株和鸭坦布苏病毒HB株由山东省农业科学院家禽研究所SPF 鸡研究中心分离和鉴定；鹅源H9N2 亚型禽流感病毒S2 株由华南农业大学兽医学院提供。

38 份疑似样品于2017 年～2018 年采自山东、江苏、安徽、河南等不同地区养鹅场。发病鹅均临床具有痛风症状，其中5 份为肾脏组织，其它均为肝脏组织。所有样品置于-80 ℃保存。

病毒DNA/RNA 提取试剂盒、RT 试剂盒及一步法RT-PCR 试剂盒购自TaKaRa 公司；LAMP 扩增试剂盒购自日本荣研化学株式会社；TE 可视染料购自天津捷易特生物科技有限公司。

1.2 引物设计与合成 参考GenBank 登录的多株鹅源 AstV 株 ORF1b 序列，在线 website: http://primerexplorer.jp/e/ 设计扩增该基因的LAMP 引物，包括内引物FIP/BIP、外引物F3/B3 和环引物LB/LF(表1)。同 时 利 用 Primer premier 5.0 软 件 设 计RT-PCR 扩增引物PCR-F/PCR-R，预期扩增400 bp。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 LAMP 和PCR 扩增引物Table 1 The primers used for LAMP and PCR

1.3 LAMP 反应的优化与建立 利用RNA 提取试剂盒提取AstV SD17 株RNA，按照RT 试剂盒说明反转录获得cDNA，利用Nano Drop ND1000 检测其浓度后进行 LAMP 反应。LAMP 反应体系 25 μL 如下：2×buffer 12.5 μL、1.0 μL 酶混合物(EM)、FIP和 BIP 各 40 pmoL、F3 和 B3 各 10 pmoL、LB 和 LF各20 pmoL，cDNA 2 μL，余下为超纯水。设ddH2O为阴性对照。为摸索LAMP 最佳反应温度，根据引物TM 值，共设置了8 个温度梯度：60 ℃、61 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、65 ℃、66 ℃、67 ℃。反应时间设置30 min、40 min、50 min、60 min、90 min时间段。反应后基于TE 指示剂颜色的改变判断结果确定LAMP 的最佳反应条件，阳性时为亮蓝色，阴性时为无色。

1.4 特异性试验 采用病毒DNA/RNA 提取试剂盒提取鹅细小病毒的DNA 以及鹅AstV SD17 株、鹅副黏病毒、鸭坦布苏病毒和鹅H9N2 亚型禽流感病毒的RNA，RNA 反转录为cDNA 后作为模板，采用上述优化的LAMP 方法进行特异性检测。每个样品设3 个重复。

1.5 敏感性试验 将反转录得到的AstV cDNA (原液浓度为100 ng/μL) 10 倍倍比稀释，共设置6 个稀释梯度(包括原液在内)，浓度依次为100 ng/μL～1 pg/μL，分别以各稀释度cDNA 为模板进行LAMP检测，验证该方法的敏感性。

1.6 临床样本检测 将来自不同养殖区域的38 份疑似发病鹅肝脏、肾脏病料样品剪碎后，按1∶3 体积加入无菌PBS，反复冻融3 次后，3 000 r/min 离心10 min，取上清备用。按照RNA 提取试剂盒说明书提取病毒RNA，反转录后以所得cDNA 为模板，按照建立的LAMP 进行检测。同时所有样品进行一步法RT-PCR 检测，25 μL 的反应体系包括：12.5 μL 2×buffer，PCR-F 和 PCR-R 各 20 pmoL、混合酶 1 μL、RNA 5 μL，余下为 ddH2O。反应过程为 RT：42 ℃ 30 min，94 ℃ 3 min；随后进行 PCR扩增 94 ℃ 20 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35 个循环，最后72 ℃4 min。反应产物经0.8 %的琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结 果

2.1 LAMP 反应优化结果 在LAMP 反应体系中，对最佳温度和作用时间进行筛选，确定最佳反应温度为64 ℃、最佳反应时间为60 min。

2.2 LAMP 特异性试验结果 利用建立的LAMP 方法分别检测AstV SD17、鹅细小病毒、鹅副黏病毒、鹅H9N2 亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒，结果显示：仅AstV 样品显示为亮蓝色，判定为阳性，其它样品颜色未见变化，均判为阴性(图1)。表明建立的LAMP 方法能够特异性地检测鹅AstV。

图1 LAMP 方法特异性检测结果Fig.1 Specificity test of LAMP reaction

2.3 LAMP 灵敏性试验结果 将10 倍梯度稀释(包括原液在内，共6 个稀释度)的AstV cDNA 模板分别进行LAMP 检测。结果显示，建立的LAMP 方法能够检测至样本的102稀释度，即1 ng/μL 的cDNA(图2)。表明该方法的敏感性较高。

2.4 临床样品检测结果 对临床采集到的38 份疑似AstV 样品，同时应用本研究建立的LAMP 和RT-PCR 方法检测(部分样品检测结果见图3)。结果显示：对5 份肾脏病料样品，2 种检测方法的阳性率一致，均为3/5；对33 份肝脏样品，LAMP 方法检出20 份阳性样品，比RT-PCR 多检出1 份(表2)，通过测序证实这份LAMP 检测阳性样品为AstV。两种方法的阳性符合率为95.65 %。综上表明，本研究建立的LAMP 检测方法更适用于临床Astv 的检测。

图2 LAMP 反应灵敏度检测结果Fig.2 Sensitivity test of LAMP reaction

表2 临床样品 LAMP 与RT-PCR 检测结果Table 2 Comparative evalution of LAMP assay with RT-PCR for clinical smples

图3 部分临床样品RT-PCR 检测结果Fig.3 Results of RT-PCR assay of some clinical samples

3 讨 论

已有研究表明AstV 不仅在我国水禽群体中分布地区十分广泛，在环境中大量存在，而且具有宽广的宿主范围[9]，能够引起鸡和火鸡的肠炎、鸡的肾炎、鸭的病毒性肝炎等，目前无可用的商业化疫苗防疫，导致AstV 难以控制和短期根除。本次疫情中患病雏鹅死淘率高达40 %以上，幸存下来的病鹅预后也较差，对疫区养鹅业造成了重大的经济损失，应对该病原引起足够的重视。因此寻找一种行之有效，简便、实用的检测方法对于该疫病的诊断和防治研究具有重要意义。

国内外对禽病常用的诊断技术诊断包括几个方面：临床诊断、病原检测、血清学诊断和分子生物学诊断等。由于目前禽病发病症状及剖检病变不典型性，仅根据临床症状已很难做到确诊；病原检测主要通过分离获得致病性病原证明病原存在，该方法确实可靠，是经典的确诊方法，但一般所需时间长、成本高，不利于疫情控制；血清学诊断方法主要根据高特异性的抗原抗体反应进行判断，对于新发病确诊难度较大；分子生物学是近年来常用的实验室诊断方法，主要通过检测病毒核酸存在证明病毒感染，包括PCR/RT-PCR、荧光定量PCR/ 荧光定量RT-PCR、LAMP、基因芯片等。本研究所用的LAMP 检测方法，是日本学者Notmomi 等最先公开报道的一种用于基因检测的恒温核酸扩增技术[10]，与其他分子生物学检测方法相比，具有快速、敏感、操作简便等特点。本研究根据GenBank 中鹅AstV ORF1b 基因保守区域的6 个特异性部位设计引物，以经RT-PCR 和电镜双重鉴定的AstV SD17 株为阳性对照，利用聚合酶混合物在恒温64 ℃条件下反应60 min 即可完成扩增，在反应管内加入TE染料根据颜色变化直接判定结果，省去了RT-PCR方法的繁琐步骤和对贵重仪器的依赖。经检测该方法特异性强、敏感性与RT-PCR 方法相当。临床样品检测显示，建立的LAMP 方法与传统的RT-PCR方法有较高的符合率，这与其他学者报道的LAMP方法用于检测禽流感、新城疫等[11-12]病毒结果相符。

综上，本研究根据AstV 的保守序列，设计特异性引物并优化反应条件，建立了AstV 的LAMP 检测方法，该方法简便、快速、特异、高效，适用于基层检测部门与检疫机构。