我国传染性法氏囊病病毒新型变异株分析研究

范林进，王雨龙，吴甜甜，李 凯，姜 楠，高玉龙，高 立，刘长军，崔红玉，潘 青，张艳萍，刘玉凤，孙先本，刘俊启，王笑梅,4*，祁小乐*

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/ 禽传染病研究室，黑龙江哈尔滨150069；2.世界动物卫生组织传染性法氏囊病参考实验室，黑龙江哈尔滨150069；3.法国诗华动物保健公司，北京100102；4.江苏高校动物重要疫病与人畜共患病协同创新中心，江苏扬州225009)

传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是鸡的一种重要免疫抑制病，严重威胁养禽业健康发展。其病原是IBD 病毒(IBDV)，其属于双RNA病毒科禽双RNA 病毒属，基因组包括两条双链RNA，即A、B 节段[1]。A 节段编码4 个蛋白，包括结构蛋白VP2 和VP3，具有水解酶活性的VP4 以及非结构蛋白VP5，其中VP2 是IBDV 的衣壳蛋白和主要保护性抗原，与病毒的毒力、细胞嗜性和抗原变异有关[2-5]。VP2 的aa206～aa350 被称为高变区(Hypervariable region，HVR)，常被用做 IBDV 的遗传演化分析[6]。

IBDV 有两个血清型，血清I 型主要引起鸡发病，血清II 型对鸡不致病。在过去的几十年里，血清I 型IBDV 主要发生过两次较大的变异，相继出现了经典株、变异株和超强株[1]。上世纪90 年代以来，以急性、高致死率为主要特征的IBDV 超强株(Very virulent IBDV，vvIBDV)席卷全球，给养禽业造成了严重损失[7-8]。经近30 年的努力，基于饲养管理水平的提高和疫苗的广泛使用等因素，vvIBDV感染逐渐被控制。然而近年来IBD 出现了新变化，非典型IBD 在我国部分鸡场相继被发现，感染鸡无明显外观症状，但其中枢免疫器官法氏囊却严重萎缩，导致其严重免疫抑制和生产性能下降，严重威胁养禽业健康发展。2017 年，本实验室率先鉴定了该疫情的病原是IBDV 新型变异株[9]。本研究初步监测了IBDV 新型变异株的流行情况，研究了其致病性，对IBD 的综合防控具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 临床样品 临床样品采集于2018 年9 月至2019 年6 月，共251 份法氏囊样品，来自于黑龙江、辽宁、河北、山东、江苏、浙江、云南共7 个省份的48 个肉鸡群(表1)。发病鸡主要为3 周龄～6周龄的免疫鸡群，呈现亚临床感染，但法氏囊组织严重萎缩，鸡的免疫力和生产性能受到影响。采集的法氏囊组织用PBS 溶液制备成10 % (w/v)的混悬液，反复冻融3 次，于4 ℃、5 000 g 离心5 min，取上清进行后续检测。

1.2 主要实验材料 ExTaq酶、RNAiso Plus 均购自TaKaRa 公司；M-MLV 反转录试剂盒购自Invitrogen 公司。IBDV 新型变异株参考毒株SHG19 由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病团队(以下简称本实验室)分离、鉴定和保存[9]。SPF 鸡购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心，饲养于负压隔离器中。

1.3 IBDV VP2 基因高变区的扩增 根据GenBank中IBDV 参考序列设计VP2 基因代表区段通用引物，上游引物P1：5'-TCACCGTCCTCAGCTTAC-3'/下游引物 P2：5'-TCAGGATTTGGGATCAGC-3'，由吉林省库美生物科技有限公司合成，预期扩增长度为643 bp。取 1.1 制备的200 μL 病料混悬液上清，根据RNAiso Plus 说明书提取总RNA，采用M-MLV反转录试剂盒反转录为cDNA，并以其为模板，PCR扩增VP2 基因片段，反应条件为：95 ℃5 min；95 ℃30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，35 个循环；72 ℃ 10 min。经1 %琼脂糖凝胶电泳检测后，将同一鸡群阳性样品的RT-PCR 产物随机选择1～2 份由吉林省库美生物科技有限公司测序。最终将所有病毒株的有效序列确定为558 bp (VP2 基因的547 bp～1 104 bp，对应于aa183～aa368)，并上传GenBank。该序列涵盖了VP2 基因的高变区(A 节段的746 bp～1 180 bp，对应于 VP2 基因的 616 bp～1 050 bp，VP2 蛋白氨基酸的aa206～aa350)。

1.4 序列分析 针对上述VP2 的558 bp 片段，利用软件 Clustal X program (version 2.0)[10]和 MEGA(version 3.1)[11]对本研究鉴定的IBDV 进行序列分析。本实验室 2017 年 9 月～2018 年 9 月鉴定的 50 株IBDV 新型变异株(表1)也基于该序列进行分析。所用的其它参考株如下：早期变异株：Variant E(USA)(AF133904)、Variant A (USA) (M64285)、GLS (USA)(AY368653)、E Del (USA) (DD187400)、9109 (USA)(AY462027)； 超 强 毒 株 ： BD399 (Bangladesh)(AF362776)、 02015.1 (France) (AJ879932)、 D6948(Netherlands) (AF240686)、 Gx (China) (AY444873)、Harbin-1 (China) (AF092171)、 HLJ0504 (China)(GQ451330)、 HK46 (China) (AF092943)、 OKYM(Japan) (D49706)、UK661 (UK) (NC-004178)、YS07(China) (FJ695138)；弱毒株：CEF94 (Netherlands)(AF133904)、 CT (France) (AJ310185)、 CU-1 (Germany) (X16107)、 D78 (USA) (AF499929)、 Gt (China)(DQ403248)、HZ2 (China) (AF321054)、JD1 (China)(AF321055)、NB (China) (AY319768)、P2 (Germany)(X84034)；经典株：IM (USA) (AY029166)；中毒力疫苗株：W2512 (MN218126)；血清 II 型病毒株：23/82(Germany)(AF362773)、OH(Canada)(U30818)。

1.5 IBDV 新型变异株动物感染试验

1.5.1 IBDV 致病性检测 选用IBDV 新型变异株SHG19 感染SPF 鸡，进行致病性试验。为了测定SHG19 的最小致病剂量，将28 日龄SPF 鸡随机分为4 组，每组10 只。将SHG19 原液10 倍倍比稀释(8×104～8×106)后分别感染第 1、2、3 组鸡，200 μL/只，感染途径为点眼滴鼻。第4 组鸡接种PBS(200 μL/只)作为空白对照。感染SPF 鸡后逐日观察鸡的临床症状。感染后第7 d 剖检所有实验鸡，观察法氏囊的病变情况。称量体重和法氏囊重量，计算囊重指数(bursa∶body-weight index，BBIX)。囊重比 =(法氏囊重/ 体重)×1 000；BBIX= 实验组鸡囊重比 / 空白对照组鸡平均囊重比；当BBIX＜0.7 时，判为法氏囊萎缩[12]。每组随机选取3 只鸡的法氏囊组织样品浸泡在10 %福尔马林溶液中，经HE 染色后，观察其病理变化。

1.5.2 法氏囊半数萎缩量(50 % buysae atrophy dose,BAD50)的测定 在1.5.1 的试验中，统计感染后第7 d每个感染组的法氏囊萎缩的鸡数，采用Reed-Muench[13]法计算该病毒的BAD50。

2 结果与讨论

2.1 IBDV VP2 基因高变区扩增结果 本研究利用1.3 中RT-PCR 共检测了来自于7 个省的疑似非典型IBD 的251 份法氏囊病料，结果显示鸡群IBDV 阳性率为77.08%(37/48)，病料IBDV 阳性率为68.53%(172/251)。最终经测序确定了32 株IBDV 株的VP2基因高变区序列，GenBank 登录号见表1。

2.2 序列分析结果 基于VP2 基因高变区的氨基酸序列进化树显示，血清I 型IBDV 明显分为经典株、超强株、减毒株和变异株4 个分支；本研究的32 株IBDV 处于变异株分支(图1)。基于VP2 基因高变区核苷酸序列的同源性分析显示，IBDV 新型变异株与美国早期变异株的同源率为91.4%～94.8%(除了GLS 株)，而与经典株、超强株、减毒株的同源率分别为89.8%～91.9%、87.6%～91.0%、88.9 %～91.9 %。在VP2 高变区中，本研究的32 株IBDV具有变异株特征性氨基酸222T、249K、286I 和318D[14-15]。表明非典型IBD 的病原是IBDV 变异株。

在进化树中，IBDV 变异株分为两个明显的亚群，美国早期变异株为一个亚群，本研究的32 株IBDV 与本实验室之前报道的IBDV 新型变异株形成了另一个亚群(图1)。IBDV 新型变异株之间的VP2基因高变区核苷酸序列的同源率为95.1 %～100 %，而与美国早期变异株的同源率仅为91.4 %～94.8 %(除了 GLS 株)。另外，IBDV 新型变异株的 VP2 高变区存在3 个不同于美国早期变异株的独特氨基酸(221K、252I 和299S)。表明我国新流行的IBDV 变异株属于IBDV 新型变异株。

本研究的32 株IBDV 新型变异株涵盖了黑龙江、辽宁、河北、山东、江苏、浙江、云南全部7个被检测省份。结合本实验室的前期研究结果，已经在我国黑龙江、吉林、辽宁、河北、北京、山东、山西、福建、江苏、安徽、湖北、浙江、云南等至少13 个省(市)检测到了IBDV 新型变异株的流行，发病鸡主要是25 日龄以上的肉鸡。这提示IBDV 新型变异株正在我国不断蔓延。

表1 IBDV 新型变异株的背景信息Table 1 Background information of IBDV novel variant strains

IBDV 变异株最早于上世纪80 年代末出现于美国，随后其在美国流行的报道一直没有间断，而且成为威胁养禽业的优势IBDV 株，造成了严重的经济损失[16-17]。IBDV 变异株于上世纪90 年代初在包括中国在内的其它国家也有零星发现，但随后鲜见流行的报道。最近我国IBDV 新型变异株的鉴定是近30 年来亚太地区关于IBDV 变异株较大范围流行的首次报道[9]。IBDV 新型变异株的起源尚无定论。有人认为是源于免疫压力下的野毒株的突变或重组；有人认为类似病毒株早就存在，只是由于人们长期以来过度关注vvIBDV 而在监测上被“忽视”了[18]。具体原因尚待进一步研究。

图1 IBDV VP2 高变区氨基酸序列进化树Fig.1 The phylogenetic tree of HVR amino acid sequence of IBDV VP2 gene

2.3 IBDV 新型变异株动物感染试验结果 和空白对照组一样，SHG19 不同剂量感染的3 个组SPF鸡，均未观察到明显外观症状。感染后第7 d 剖检发现，与空白对照组相比，8×104和8×105两个稀释剂量组SPF 鸡的法氏囊呈现明显萎缩，质地变硬，BBIX 分别为 0.322±0.045 和 0.342±0.070；8×106稀释剂量组SPF 鸡法氏囊大小正常，BBIX 为1.077±0.209 (图2A 和2B)。组织病理学切片显示，SHG19感染组萎缩的法氏囊中滤泡结构受到破坏，淋巴细胞显著减少，个别滤泡髓质可见少量异嗜细胞浸润，局部成纤维细胞增生，对照组无明显病理变化(图2C)。

IBDV 新型变异株引起的非典型IBD 的危害不容忽视。一方面，IBDV 新型变异株虽然不致死鸡，但却造成鸡中枢免疫器官法氏囊严重萎缩，导致机体免疫力降低，易继发和并发其它疫病。另一方面，IBDV 新型变异株会干扰其它重要疫病疫苗的免疫效果。前期研究数据显示，IBDV 新型变异株的感染严重干扰了禽流感H5/H7 二联疫苗的抗体产生[9]。再者，IBDV 新型变异株的感染严重影响增重等生产性能[9]。

前期研究显示，IBDV 新型变异株在CEF、DF1等细胞中不能产生细胞病变，对鸡胚的致病性也较弱，无法采用传统的TCID50(50 % tissue culture infective dose)或 ELD50(50 % embryo lethal dose)进行病毒效价的测定，这在一定程度上限制了对该病的进一步研究。系统的致病性研究发现，法氏囊萎缩是IBDV 新型变异株感染鸡的一个具有重要示病意义的症状，本研究首次提出了BAD50的概念，即能造成半数鸡的法氏囊萎缩的病毒感染剂量。用10 倍比稀释的IBDV 变异株感染28 日龄SPF 鸡，每个稀释度10 只鸡，感染后第7 d 剖检，依据BBIX 统计各组鸡的法氏囊萎缩数，采用Reed-Muench[13]法计算病毒的BAD50。本研究对IBDV 新型变异株SHG19的 BAD50测定结果显示，8×104和 8×105稀释剂量组的10 只鸡法氏囊全部萎缩，8×106稀释剂量组的10只鸡法氏囊均正常(图2A 和 2B)，计算出本批SHG19 的效价为 1.26×106BAD50/100 μL。

图2 IBDV 新型变异株的动物感染实验Fig.2 Animal infection experiment of novel variant strains of IBDV

值得注意的是，本研究的IBDV 新型变异株均是在免疫鸡群中检测到的，这提示针对vvIBDV 的现有疫苗可能不能对IBDV 新型变异株提供完全保护。前期研究发现，与vvIBDV 及其减毒疫苗株相比，IBDV 新型变异株具有完全不同的单克隆抗体反应谱特征[9]。IBDV 新型变异株的分子流行病学、遗传变异机制、免疫抑制机制以及对疾病的有效防控措施亟需深入研究。