山羊副流感病毒3型感染MDBK细胞和BECs后7种ISGs mRNA变化分析

肖 芳，嵇辛勤，李基棕，廖 政，毛 立，李文良，孙 敏，刘茂军

(1.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025；2.江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室，江苏南京210014)

山羊副流感病毒3 型(Caprine parainfluenza virus type 3，CPIV3)属于副粘病毒科(Paramyxoviridea)，副粘病毒亚科(Paramyxovirinea)、呼吸道病毒属(Respirvirus)成员，与其同属的成员还包括人副流感病毒1 型(Human PIV1，HPIV1)和人副流感病毒3型 (Human PIV3，HPIV3)、 仙 台 病 毒 (Sendai virus，SV)以及牛副流感病毒 3 型(Bovine PIV3，BPIV3)[1]，它们均是有囊膜的单股负链RNA 病毒[2]。2013 年，在江苏省发病羊群中检测出了CPIV3，患病羊群的呼吸道表现出不同程度的感染，通过RT-PCR 扩增CPIV3 N、M、F、HN 和L 基因并测序，结果显示该病毒与HPIV3、BPIV3 的同源性仅为76.9 %～83.5 %，在进化树上处于独立分支[3]。随后的致病性研究中显示，用CPIV3 JS2013 株对山羊进行感染试验，患病羊临床表现以咳嗽、眼分泌物增多、流鼻涕、体温升高等为主要特征。表明CPIV3 是威胁羊群健康的主要呼吸道病原之一，研究其致病机制和宿主细胞抗病毒免疫应答意义较大。

SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 广泛应用于细胞因子转录水平和病毒定量等方面的研究。细胞因子在机体的细胞免疫、抗感染免疫以及抗排斥反应等方面均有积极作用[4]。干扰素刺激基因(Interferon stimulated genes，ISGs)作为抗病毒功能的执行者，研究其对CPIV3 抗病毒作用具有十分重要的意义，对动物机体内ISGs 转录水平的准确定量，对评价机体的免疫状态，揭示动物疾病的发病机理和探索机体免疫应答规律有一定的科学意义。

本研究室在前期研究中将CPIV3 HA 2014-1 株感染MDBK 细胞，发现有的ISGs 转录水平显著上调，提示宿主细胞通过产生抗病毒因子来干扰CPIV3 增殖，但CPIV3 HA 2014-1 株无血凝性，致病性较弱。相比之下，CPIV3 JS2013 株有血凝性，致病性较强。因此，为深入研究该株病毒的致病机制，本研究首先建立 7 种 ISGs：IFI6、ISG15、OAS1Y、OAS1Z、Mx1、Mx2和RSAD2基因 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 检测方法，并应用所建立的方法检测CPIV3 JS2013 株感染MDBK 细胞和气管上皮细胞(BECs)不同时间点该7 种ISGs 的转录水平。为深入研究宿主细胞免疫防御机制提供技术支持，并为进一步探究ISGs 的抗病毒作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 MDBK 细胞购自中国兽医药品监察所；BECs 为本实验室保存；pEGFP-N1 载体购自优宝公司；CPIV3 JS2013 株为本实验室分离并保存；质粒提取和DNA 凝胶回收试剂盒等购自AxyGEN 公司；逆转录试剂盒及其它PCR 试剂购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 检测各目的基因的荧光定量PCR 方法的建立

1.2.1 引物的设计与合成 根据GenBank 登录的7种ISGs 基因序列，设计特异性引物用于扩增目的基因和荧光定量PCR 检测(表1)。引物均由南京擎科生物科技有限公司合成。

1.2.2 各目的基因质粒标准品的构建与鉴定 利TRIzol试剂盒提取MDBK 细胞的总RNA，反转录为cDNA 后以其为模板PCR 扩增各目的基因。分别将扩增片段纯化后克隆于pEGFP-N1 载体，构建的重组质粒标准品经酶切鉴定后测序分析。

1.2.3 检测各目的基因的荧光定量PCR 方法的优化及各标准曲线的建立 将20 μL 的反应体系进行优化：10 μmol/L 上、下游引物各 0.2 μL～1.0 μL (每0.2 μL 为一个梯度)、2×TransStartqPCR SuperMix 10 μL、50×Dye 0.4 μL、模板 2.0 μL、无核酶水补至20 μL。同时设置阴性对照。反应程序为：94 ℃30 s；94 ℃ 5 s，50 ℃～60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40～45 个循环。将构建的7 种质粒标准品测定浓度并换算为拷贝数后，将其10 倍倍比稀释后分别作为模板，经建立的荧光定量化R 扩增，反应结束后，绘制各标准曲线。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.4 特异性和敏感性试验 通过溶解曲线，分析建立的各目的基因荧光定量PCR 方法的特异性。将质粒标准品10 倍倍比稀释后为作为模板进行SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR 扩增，并设空白对照以评价该方法的敏感性。

1.3 MDBK 细胞接种 CPIV3 JS2013 株后 7 种 ISGs 基因mRNA 转录水平的变化 将形态良好的MDBK 细胞传代至12 孔板中，待细胞汇合度达到60 %～80 % 时接种 MOI 1 的 CPIV3 JS2013 株病毒液，同时用正常细胞做对照。在接种24 h、48 h 和72 h 后分别收获感染细胞和正常细胞，提取RNA，反转录为cDNA 后以其为模板，采用建立的荧光定量PCR 方法检测接种不同时间的细胞和正常细胞中的IFI6、ISG15、OAS1Y、OAS1Z、Mx1、Mx2和RSAD2基因转录水平。

1.4 BECs 接种 CPIV3 JS2013 株后 7 种因 mRNA转录水平的变化 按1.3 方法培养 BECs 并接种CPIV3 JS2013 株病毒，提取接种病毒24 h、48 h、72 h 后细胞与对照细胞的PNA 并反转录为cDNA 后作为模板，采用建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR 方 法 进 行IFI6、ISG15、OAS1Y、OAS1Z、Mx1、Mx2和RSAD2基因 mRNA 转录水平的定量检测。

1.5 统计分析 本研究所有数据均采用SAS 软件进行统计学分析，通过ANOVA、Least significance difference (LSD) 方法进行计算。*：p＜0.05 为差异显著；**：p＜0.01、 ***：p＜0.001 表示差异极显著。

2 结 果

2.1 各目的基因质粒标准品的构建与鉴定 各目的基因经PCR 扩增，结果显示均与预期大小相符(图略)。重组质粒pEGFP-IFI6、pEGFP-ISG15、pEGFPOAS1Y、pEGFP-OAS1Z、pEGFP-Mx1、pEGFP-Mx2和pEGFP-RSAD2 通过双酶切鉴定显示所得片段大小与预期结果一致(图1)。表明，含各目的基因的质粒标准品正确构建。

图1 各目的基因重组质粒标准品的酶切鉴定结果Fig.1 Restriction enzyme identification of recombinant plasmid standards

2.2 荧光定量PCR 方法的优化及标准曲线的建立通过对反应条件的优化，最终确定引物浓度为10 μmol/L，退火温度为50 ℃时Ct 值最小及荧光值最高，且没有引物二聚体产生。最终优化的反应体系：模板 2 μL (1×105copies/μL)，2×TransStartqPCR SuperMix 10 μL，上、下游引物各 0.4 μL，50×Dye 0.4 μL，无核酶水 6.8 μL；反应程序为 94 ℃30 s；94 ℃ 5 s、50 ℃ 15 s、72 ℃ 10 s，40 个循环。

将7 种质粒标准品测定浓度并换算为拷贝数后，将其均稀释到5×1010拷贝/μL，再10 倍倍比稀释6个浓度后作为模板进行各荧光定量PCR 扩增。结果显示扩增曲线良好(图2)，表明建立了检测IFI6、ISG15、OAS1Y、OAS1Z、Mx1、Mx2和RSAD2基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 方法。

2.3 特异性和敏感性试验结果 各溶解曲线显示IFI6、ISG15、OAS1Y、OAS1Z、Mx1、Mx2和RSAD2基因扩增产物均出现特异性单峰(图3)。以7 种质粒标准品10 倍倍比稀释后作为模板进行该SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 反应，结果显示，各质粒标准品的浓度为5×101拷贝/μL。结果表明，建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 方法特异性较强、敏感性较高。

2.4 MDBK 细胞接种 CPIV3 JS2013 株后 7 种 ISGs 基因mRNA 转录水平的检测结果 采用建立的荧光定量 PCR 方法检测 MDBK 细胞接种 CPIV3 JS2013 株各时间点各基因mRNA 的转录水平。结果显示，接种病毒后，感染组细胞7 种ISGs基因mRNA转录水平随感染时间延长而提高，与对照组中相比，感染组细胞7 种ISGs转录水平至少上调了3倍以上，其中ISG15、Mx1、Mx2和RSAD2基因的转录水平上调量持续高于IFI6、OAS1Y和OAS1Z基因的转录水平(图4)。结果表明，MDBK 细胞在受到CPIV3 刺激后ISGs 的转录水平会显著上调。

2.5 BECs 接种 CPIV3 JS2013 株后 7 种 ISGs 基因mRNA 转录水平的检测结果 采用建立的荧光定量PCR 方法检测BECs 接种CPIV3 JS2013 株各时间点各基因mRNA 的转录水平。结果显示，接种病毒后，感染组细胞7 种ISGs基因mRNA 转录水平均上调，其中ISG15、Mx2和RSAD2的转录水平上调量明显高于IFI6、OAS1Y、OAS1Z和Mx1基因的转录水平(图5)。结果表明，CPIV3 刺激BECs 后ISGs的转录水平虽会出现上调，但是不同ISGs 的转录水平上调量有所差异。

图2 7 种SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 扩增曲线和标准曲线Fig.2 Amplification curves and stand curves of 7 standard plasmid by SYBR GreenⅠreal-time PCR

图3 7 种SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 溶解曲线Fig.3 Melting curves of 7 standard plasmid by SYBR GreenⅠreal-time PCR

图4 MDBK 细胞接种CPIV3 JS2013 株后7 种ISGs 的mRNA 转录水平检测结果Fig.4 Transcription levels of seven ISGs mRNAs in MDBK cells infected CPIV3 JS2013 strain

图5 BECs 接种CPIV3 JS2013 株后7 种ISGs 的mRNA 转录水平检测结果Fig.5 Transcription levels of seven ISGs mRNAs in BECs infected CPIV3 JS2013 strain

3 讨 论

对CPIV3 的研究水平还处在初步阶段。由于CPIV3 在MDBK 细胞中生长速度快，且可稳定传代，所以在前期研究中，本研究室一直使用MDBK细胞做各项研究，但CPIV3 的靶器官是呼吸器官，使用MDBK 细胞具有一定局限性。后来发现，CPIV3 能够感染BECs，且能够有效增殖。因此本研究将CPIV3 分别接种于MDBK 细胞和BECs，比较两种不同细胞系感染CPIV3 后的ISGs 转录水平差异。

Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)反应是由病原体感染宿主后产生的，在宿主防御体系中起着重要作用[6-7]。IFNs产生后会结合细胞表面的IFNs 受体，从而启动JAK-STAT 信号通路，大量的ISGs 被诱导转录。IFNs 诱导的ISGs 多达300 个，只有部分ISGs 的抗病毒活性和相关机制得以阐明，绝大多数ISGs 的相关生物学和抗病毒作用机制还有待于深入探究。

IFI6 是被 IFN-α 和 IFN-β 诱导表达上调的 ISGs之一。目前，在IFI6mRNA 转录水平的研究方面未有报道。本实验中不同时间点正常MDBK 细胞mRNA 转录水平基本趋于一致，但经CPIV3 JS2013 株刺激后细胞中IFI6基因会被大量诱导转录；正常BECs mRNA 转录水平有所差异，这可能与细胞汇合度有关，经CPIV3 JS2013 株刺激后IFI6基因会被诱导转录，且与对照细胞相比二者差异倍数至少在3 倍以上。由于CPIV3 JS2013 株刺激后两种细胞IFI6mRNA 转录水平均出现上调，表明两种细胞抵抗CPIV3 感染的过程基本一致。

本实验中在感染病毒的24 h、48 h 和72 h 3 个时间点，随着感染时间延长，两种细胞中ISG15mRNA 转录水平持续上调，与杨晶等认为JEV 接种ST 细胞 24 h 后ISG15的相对mRNA 转录水平有明显升高结果基本一致[8]。表明病毒的增殖可以诱导MDBK 细胞和 BECs 中ISG15mRNA 的转录。

OAS 最先在人体细胞中被发现，后来在小鼠、牛和猪等其他动物体内也相继被发现[9]。由于OAS能直接行使抗病毒功能，研究其mRNA 的转录水平尤为重要。接种病毒24 h 时MDBK 细胞中OAS1Y和OAS1ZmRNA 转录水平相差不大，但在接种病毒 48 h 和 72 h 时OAS1Y和OAS1ZmRNA 转录水平的差异倍数越来越大。这表明OAS1Y 和OAS1Z虽属于同一家族，但被病毒感染后其mRNA 转录水平会有所差异，这可能会影响后续其的抗病毒效果。

Zurcher T 证实Mx 在病毒侵入机体后能够阻碍其核酸在细胞中的早期转录[10]。无论是接种病毒24 h、48 h 还是 72 h，BECs 中Mx1和Mx2mRNA 转录水平差异倍数均低于二者在MDBK 细胞中的转录水平差异。推测 CPIV3 JS2013 株感染 MDBK 细胞和BECs 后，宿主细胞会诱导大量的ISGs 来抑制病毒增殖，但不同细胞诱导的ISGs 水平存在差异，推测这可能是机体和病毒长期进化互相适应生存产生的结果。

RSAD2 也称Viperin，最早发现于感染人细胞巨化病毒的成纤维细胞中[11]。MDBK 细胞和 BECs 接种 CPIV3 JS2013 株后 48 h 和 72 h，RSAD2mRNA转录水平的差异倍数最大，且感染时间和RSAD2mRNA 转录水平具有相关性，这与曲靖格的研究结果类似[12]。

大量文献报道IFI6、ISG15、OAS1Y、OAS1Z、Mx1、Mx2和RSAD2基因所编码的蛋白可以直接抑制病毒的增殖，从而起到抗病毒作用[13-17]。因此，检测IFI6、ISG15、OAS1Y、OAS1Z、MX1、MX2和RSAD2基因在MDBK 细胞和BECs 中的转录水平，为进一步研究它们在抗CPIV3 方面的功能提供了实验依据。