颅内动脉瘤破裂出血术后血清HIF-1α、miR-210表达与脑血管痉挛的关系

张玉清 陶立玉 张子轩

蛛网膜下腔出血（subarachniod hemorrhage，SAH）是脑底部或脑表面的病变血管破裂，血液直接流入蛛网膜下腔的一种疾病，可分为自发性与继发性，其中自发性SAH在临床上更为常见[1]。颅内动脉瘤是一种常见的脑血管疾病，是诱导动脉瘤破裂致自发性SAH的最主要原因[2]。目前治疗颅内动脉瘤破裂出血患者的主要方法是行开颅手术夹闭动脉瘤或介入栓塞治疗，但术后极易引发脑血管痉挛（cerebral vasospasm，CVS）[3]。研究表明，CVS是因局部脑血管收缩时受累脑组织区域血供减少，从而引起缺血缺氧性神经功能损害，是患者致残、致死的主要原因之一[4]。及早预测及诊治CVS，对于降低颅内动脉瘤破裂出血患者死亡率具有积极的意义。缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是机体缺氧适应过程中起核心调控作用的转录因子，与创伤性颅脑损伤中血管的修复与再生过程密切相关[5]。miR-210是微小RNA（microRNA，miRNA）家族成员之一，其表达水平与缺氧缺血性脑损伤新生鼠脑血管再生有关[6]。但关于HIF-1α、miR-210在颅内动脉瘤破裂出血患者术后血清中的表达情况，目前鲜有报道，基于此，本研究通过检测颅内动脉瘤破裂出血术后血清中HIF-1α、miR-210的表达情况，旨在探讨其与CVS的关系，现报道如下。

资料与方法

一、一般资料

选取禹城市人民医院神经外科自2015年1月至2018年12月收治的87例颅内动脉瘤破裂急诊自发性SAH并接受手术治疗的患者为研究对象，其中男性49例，女性38例；年龄范围35～75岁，年龄（46.17±15.28）岁；按Hunt氏法分级，术前Ⅰ～Ⅱ级48例，Ⅲ～Ⅳ级39例[7]。纳入标准：（1）均以蛛网膜下轻出血为首发症状；（2）经头颅X线、CT及全脑数字减影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）检查确诊；（3）均接受手术治疗。排除标准：（1）SAH造影为阴性；（2）术前或术中发生再次出血；（3）术后因高血压、脑梗死或脑室外引流术中穿刺等引起的再出血；（4）严重精神病、妊娠期、哺乳期、过敏体质及严重肝肾等脏器功能不全。

二、诊断标准与评定方法

CVS诊断标准[8]：（1）患者经治疗后出现恶化或进行性加重；（2）意识性障碍呈波动性或进行性加重；（3）出现感觉障碍、失语、偏瘫等体征；（4）颅内压升高；（5）血流容量大脑前、中动脉≥120 cm/s，后动脉≥90 cm/s。

CVS评定方法：术后4 d行DSA检查，测量脑中动脉（M1、M2段）、前动脉（A1、A2段）及血管最狭窄处直径，根据健康人脑血管直径作为基准，评估CVS严重程度。无CVS：患者脑血管直径与正常脑血管直径相比，减少度＜10%；轻度CVS：10%≤减少度＜35%；中度CVS：35%≤减少度＜70%；重度CVS：70%≤减少度＜100%。

三、标本采集与检测

标本采集：分别于术前1 d和术后3、7 d采集患者肘静脉血5 mL，室温静置0.5 h后，在离心机（2500 r/min，离心半径13.5 cm）上离心20 min，取上清液，并置于-70℃冰箱中保存待测。

血清HIF-1α水平：采用HIF-1αELISA检测试剂盒检测血清HIF-1α水平，检测过程严格按照试剂盒说明书进行，HIF-1α检测试剂盒购自上海研生实业有限公司。

血清miR-210水平：采用RNA提取试剂盒提取RNA，使用反转录试剂盒得cDNA，采用miScript SYBR Green PCR Kit检测血清miR-210水平，反应体系20μL，具体步骤参见各试剂盒说明书，qRTPCR反应条件：95℃，120 s；95℃，30 s；60℃，60 s，共35个循环。RNA提取试剂盒购自上海赛默飞世尔科技有限公司，反转录试剂盒及miScript SYBR Green PCR Kit购自上海索莱宝生物科技有限公司。miR-210的上游引物序列：TCAGCCGCTGTCACACGCAC AG；下游引物序列：TTCTCCGAACGTGTCACGTT TC；内参U6的上游引物序列：ATTGGAACGATACA GAGAAGATT；下游引物序列：GGAACGCTTCACG AATTTG。采用2-△△Ct法对miR-210水平进行定量分析。

四、统计学分析

采用SPSS20.0软件进行统计学分析，计量资料先进行正态分布检验。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，方差分析有统计学意义者再进一步采用LSD-t检验。计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用Pearson相关性分析法分析颅内动脉瘤破裂出血术后血清HIF-1α、miR-210表达的相关性，采用ROC曲线分析颅内动脉瘤破裂出血术后3 d患者血清HIF-1α、miR-210水平对CVS的诊断价值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、不同程度CVS患者的临床资料比较

87例颅内动脉瘤破裂出血患者中，术后无CVS者50例（57.47%），出现CVS患者37例（42.53%），其中轻度CVS10例（11.49%）、中度19例（21.84%）、重度8例（9.20%）。不同程度CVS患者性别比例、年龄、BMI、Hunt氏法分级比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。详细信息见表1。

表1 不同程度CVS患者的临床资料比较

二、不同程度CVS患者颅内动脉瘤破裂出血术后血清HIF-1α、miR-210水平比较

术前不同程度CVS患者血清HIF-1α、miR-210水平相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。术后3、7 d，不同程度CVS患者血清中HIF-1α、miR-210水平与无CVS组患者相比均显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05），且CVS程度越重，血清HIF-1α、miR-210表达水平越高。不同程度CVS患者术后3、7 d的血清HIF-1α、miR-210水平均显著高于术前，差异有统计学意义（P＜0.05）；术后7 d时血清HIF-1α、miR-210水平均显著低于术后3 d，差异有统计学意义（P＜0.05）。详细信息见表2。

表2 不同程度CVS患者颅内动脉瘤破裂出血术后血清HIF-1α、miR-210水平比较（）

表2 不同程度CVS患者颅内动脉瘤破裂出血术后血清HIF-1α、miR-210水平比较（）

与无CVS组比较，a P＜0.05；与轻度CVS组比较，b P＜0.05；与中度CVS组比较，c P＜0.05；与术前比较，d P＜0.05；与术后3 d比较，e P＜0.05；CVS：脑血管痉挛；HIF-1α：缺氧诱导因子1α；miR-210：微小RNA-210

三、颅内动脉瘤破裂出血术后血清HIF-1α、miR-210表达的相关性

颅内动脉瘤破裂出血术后3、7 d患者血清HIF-1α水平与miR-210水平均呈正相关（r=0.381、P=0.012，r=0.631、P=0.000）（图1）。

图1 颅内动脉瘤破裂出血术后血清HIF-1α、miR-210表达的相关性分析

四、ROC曲线分析颅内动脉瘤破裂出血术后3 d患者血清HIF-1α、miR-210水平对CVS的诊断价值

术后3 d颅内动脉瘤破裂出血患者血清HIF-1α水平诊断CVS的曲线下面积（areaunder thecurve，AUC）为0.834（95%CI：0.748～0.920，P=0.000），诊断分界点为84.82 pg/mL，血清miR-210水平诊断颅内动脉瘤破裂出血患者CVS的AUC为0.769（95%CI：0.662～0.877，P=0.000），二者联合诊断颅内动脉瘤破裂出血患者CVS的AUC为0.900（95%CI：0.830～0.970，P=0.000）（图2）。

五、血清HIF-1α、miR-210检测CVS的诊断价值

HIF-1α取最佳截断值84.82 pg/mL时，检测CVS的敏感度为81.80%，准确度为80.46%；miR-210取最佳截断值1.09时，检测CVS的敏感度为59.46%，准确度为77.01%。HIF-1α、miR-210二者联合检测CVS的敏感度为94.59%、准确度为87.36%，均高于HIF-1α、miR-210单独检测。详细信息见表3～4。

讨 论

颅内动脉瘤性SAH是常见的出血性脑血管疾病，多由动脉瘤及血管畸形破裂出血等引起，其总年发病率约9.1/10万，病死率约50%，30%存活者生活不能自理，威胁人类身体健康[9]。CVS是指颅内动脉的持续性收缩状态，是颅内动脉瘤性SAH最常见的并发症，发生率达40%～80%，由血管内皮细胞及平滑肌细胞超微结构和功能改变、血管收缩作用的增强和舒张作用的减弱所致，常引起严重的局部脑组织缺血或迟发性脑损伤，是患者重残或死亡的主要原因[10]。目前临床上尚缺乏有效的CVS诊断指标，因此继续寻找特异、有效的生物学指标对于早期预测及诊断CVS的发生、降低颅内动脉瘤破裂出血患者的死亡率具有积极的意义。

图2 术后3 d患者血清HIF-1α、miR-210水平诊断脑血管痉挛的ROC曲线

表3 血清HIF-1α、miR-210检测脑血管痉挛的诊断结果

表4 血清HIF-1α、miR-210检测脑血管痉挛诊断价值（%）

HIF-1α是HIF-1的功能性亚基，是一种介导机体对缺氧环境产生应答的重要转录因子，在低氧环境中能够调节稳态平衡及介导低氧反应[11]。董静和刘群[12]研究表明，HIF-1α在人脑出血灶周脑组织中表达明显上调，其表达水平与脑水肿密切相关。miR-210是一种缺氧特异性miRNA，在机体缺氧条件下表达上调[13]。研究表明，当人大脑处于严重缺血缺氧状态时，其血液中miR-210表达水平会明显变化，其表达水平与脑损伤情况有关[14]。王新立等[15]研究表明，miR-210的表达水平与SAH大鼠迟发性CVS的发生有关。本研究结果显示42.53%的颅内动脉瘤破裂出血患者出现CVS。术后3、7 d，与无CVS患者相比，不同程度CVS患者血清中HIF-1α、miR-210水平均显著升高，且CVS程度越重，血清HIF-1α、miR-210表达水平越高，提示血清HIF-1α、miR-210水平可能与CVS进展有关。不同程度CVS患者术后7 d血清HIF-1α、miR-210水平均显著低于术后3 d，提示可能是受手术的影响；术后3 d患者血清HIF-1α、miR-210水平较高，血清HIF-1α、miR-210水平随着术后时间的延长，其表达动态变化可能在一定程度上指导临床治疗方案的调整。

本研究进一步分析颅内动脉瘤破裂出血术后血清HIF-1α与miR-210表达的关系，结果显示颅内动脉瘤破裂出血患者术后3、7 d血清HIF-1α水平与miR-210水平均呈正相关，提示血清HIF-1α、miR-210可能具有一定调节关系，共同参与颅内动脉瘤破裂出血患者术后CVS的发生及发展。采用ROC曲线分析其诊断价值，结果显示颅内动脉瘤破裂出血术后3 d患者血清HIF-1α水平诊断CVS的AUC为0.834，诊断分界点为84.82 pg/mL，血清miR-210水平诊断CVS的AUC为0.769，二者联合诊断颅内动脉瘤破裂出血患者CVS的AUC为0.900，敏感度为93.06%，准确度为87.36%，均高于单项指标检测。提示血清HIF-1α、miR-210水平对颅内动脉瘤破裂出血术后CVS早期诊断可能具有一定的参考价值，二者联合检测可能成为CVS发生、发展的重要生物学指标。

综上所述，颅内动脉瘤破裂出血术后血清HIF-1α、miR-210水平可有效预示CVS的发生，二者可能成为CVS发生、发展的重要生物学指标。然而本研究仅探究了颅内动脉瘤破裂出血术后血清HIF-1α、miR-210表达与CVS的关系，具体生物学调节机制尚不清楚，仍需进一步研究。