花生蛋白亚基组成对蛋白提取率及功能性质的影响

贾 聪，芦 鑫，高锦鸿，孙 强，黄纪念，张丽霞

(河南省农业科学院 农副产品加工研究所，郑州450000)

花生属于豆科植物，是一种重要的油料蛋白资源。花生中蛋白质含量为24%～36%，花生蛋白营养价值较高，包括人体必需的8种氨基酸，具有易消化、不含营养抑制物质等优点，具有广阔的市场发展前景[1]。花生蛋白根据其溶解性可分为水溶性蛋白(约10%)和盐溶性蛋白(约90%)[2]。水溶性蛋白主要是清蛋白，在提取花生蛋白的过程中大部分易丢失。盐溶性蛋白包括伴花生球蛋白Ⅰ、伴花生球蛋白Ⅱ和花生球蛋白[3]。伴花生球蛋白Ⅰ主要由3个亚基组成，相对分子质量在15.0～19.0 kDa之间；伴花生球蛋白Ⅱ含1个亚基，相对分子质量基本处于60～66 kDa之间；花生球蛋白主要有4个亚基，相对分子量处于20～45 kDa之间。有研究发现不同品种花生蛋白的亚基含量具有差异性，主要差异在于花生球蛋白亚基组成的不同[4-5]。榨油副产物花生粕的蛋白质含量高达50%，我国每年产生900多万t花生粕，但大部分被用作饲料或肥料[6]，未资源化利用，资源浪费严重。

目前，花生蛋白研究主要聚焦在对花生蛋白的提取工艺优化和加工利用[7-9]，而关于花生蛋白组成(亚基)影响蛋白提取的研究鲜见报道。同时，为指导花生蛋白应用，研究了花生蛋白的功能性质(主要包括溶解性、乳化性、起泡性、持水性及持油性等)，虽然获得一些进展，然而关于花生蛋白亚基如何影响其功能性质尚不明确。因此，开展花生蛋白亚基对花生蛋白提取与功能性质的影响研究，对预测花生品种在食品工业中的应用以及专用品种的选育具有重要意义。

本文采用碱溶酸沉法提取21个品种花生的蛋白质，利用SDS-PAGE分析花生蛋白亚基组成，并对花生蛋白提取率、溶解性、乳化性、起泡性、持水性及持油性进行测定，通过相关性分析明确花生蛋白亚基与蛋白提取率及功能性质的交互作用，为蛋白加工业中选择适宜花生品种以及花生育种指导提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

花生，河南绿色油料作物研究中心提供；花生油，山东鲁花集团有限公司。β-巯基乙醇、考马斯亮蓝R-250、过硫酸铵、溴酚蓝，美国Sigma公司；电泳Marker (相对分子质量10～250 kDa)，上海雅酶生物科技有限公司；丙烯酰胺、N,N′-亚甲双丙烯酰胺、甘氨酸、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺等，美国Amersco公司；2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠(BCA)、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、十二烷基硫酸钠(SDS)、冰醋酸、五水硫酸铜、硫酸钾、盐酸、氢氧化钠，国药集团化学试剂有限公司，以上试剂均分析纯。

1.1.2 仪器与设备

DYY-12型电泳仪，北京市六一仪器厂；ULTRA-TURRAX型高速剪切乳化机，德国IKA公司；UV-6300型紫外分光光度计，上海美谱达公司；RRHP-350型粉碎机，上海顶帅电器有限公司；FD5-3型冻干机，德国SRK公司；DL-5-B型离心机，上海安亭科学仪器厂；DELTA 320型pH计，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；Gel-Doc XR+凝胶成像仪，美国伯乐生命医学产品有限公司；K-05型自动定氮仪，上海晟声自动化分析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 花生蛋白提取

将花生(花生品种如表1所示)去除红衣后，粉碎过60目网筛，取200 g筛下物采用索氏抽提法去除油脂，花生粕与去离子水以1∶10混合，将分散液调节pH为11.0，40℃下搅拌1 h，5 000 r/min 离心30 min，取上清调pH为4.5，静置20 min，5 000 r/min 离心30 min，取沉淀，冻干，得到粗提的花生蛋白。

表1 花生品种

1.2.2 花生蛋白提取率的测定

采用凯氏定氮法分别测定1.2.1中花生粕和碱溶酸沉法得到粗提物的花生蛋白含量。花生蛋白提取率的计算如式(1)所示。

花生蛋白提取率=粗提物质量×粗提物蛋白含量/(花生粕质量×花生粕蛋白含量)×100%

(1)

1.2.3 花生蛋白SDS-PAGE分析

将花生粕和粗提花生蛋白(均含4 mg蛋白)分别分散到1 mL样品处理液(含0.05 mol/L pH 6.8 Tris-HCl，50 g/Lβ-巯基乙醇，20 g/L SDS，1 g/L溴酚蓝，100 g/L甘油)中，沸水浴加热10 min，10 000 r/min离心10 min后弃沉淀。电泳条件：分离胶质量分数为12.5%，浓缩胶质量分数为3%，上样量为5 μL，电流为15 mA。结束后取出凝胶采用考马斯亮蓝R-250 染色1 h，然后用体积分数均为10%的甲醇和冰醋酸脱色。凝胶扫描利用Gel-Doc XR+凝胶成像仪。亚基含量计算采用Image Lab 软件，并采用标准差与平均值的比值计算变异系数，量化比较不同品种的花生蛋白亚基含量间的差异性。

1.2.4 花生蛋白溶解性的测定

称取粗提花生蛋白(含0.5 g蛋白)，将其分散到50 mL磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L、pH 7.0)中，搅拌2 h后，在5 000 r/min下离心30 min取上清。采用Lowry法测定上清液中花生蛋白含量，牛血清白蛋白为标准蛋白[10]。花生蛋白溶解性计算如式(2)所示。

花生蛋白溶解性=上清液质量×上清液中蛋白含量/样品中蛋白质量×100%

(2)

1.2.5 花生蛋白乳化性的测定

将粗提花生蛋白分散于0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液中，分散液中花生蛋白质量浓度为1 g/L，取40 mL分散液并向其中加入10 mL花生油，10 000 r/min高速剪切1 min后迅速从底部吸取20 μL乳液，用1 g/L SDS稀释至5 mL，在500 nm处测定吸光度。10 min后采用同样操作测定吸光度。空白参照为1 g/L SDS溶液。花生蛋白乳化活性和乳化稳定性[11]计算如式(3)和式(4)所示。

(3)

(4)

式中：EAI为乳化活性，m2/g；ESI为乳化稳定性，min；N为乳液稀释倍数；A0为0 min时的吸光度；At为10 min时的吸光度；φ为油相比例；C为初始蛋白质量浓度，g/mL。

1.2.6 花生蛋白起泡性的测定

参照Huang等[12]的方法并略有改动。将粗提花生蛋白分散于0.1 mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)中，分散液中花生蛋白质量浓度为1 g/L，取40 mL分散液于10 000 r/min高速剪切2 min，立即转入100 mL量筒中，记录样品体积及静置30 min后样品体积。起泡能力和泡沫稳定性的计算如式(5)和式(6)所示。

(5)

(6)

式中：FC为起泡能力；FS为泡沫稳定性;V1为0 min量筒中样品体积,mL；V2为30 min后量筒中样品体积,mL。

1.2.7 花生蛋白持水性的测定

参照张晓兰等[13]的方法。称取粗提花生蛋白(含0.5 g蛋白)于离心管中，向其中加入10 g去离子水，混匀后静置30 min，然后在3 000 r/min下离心10 min，去除上层未吸附澄清水。花生蛋白持水性计算如式(7)所示。

持水性=样品吸水量/样品中花生蛋白质量×100%

(7)

1.2.8 花生蛋白持油性的测定

参照张晓兰等[13]的方法。称取粗提花生蛋白(含0.5 g蛋白)于离心管中，向其中加入4 g花生油，混匀后静置30 min，然后在3 000 r/min下离心10 min，去除上层未吸附油。花生蛋白持油性计算如式(8)所示。

持油性=样品吸油量/样品中花生蛋白质量×100%

(8)

1.2.9 数据统计分析

所有实验均重复3次，数据表达取平均值，并使用SPSS Statistics 20 软件对数据结果进行相关性分析，在p<0.05水平上显著相关，在p<0.01水平上极显著相关。

2 结果与讨论

2.1 花生蛋白亚基分析

21个品种的花生蛋白和花生粕的SDS-PAGE图谱如图1所示。由图1可知，花生蛋白主要由伴花生球蛋白Ⅱ(65.4 kDa)、花生球蛋白(42.1、40.5、36.8 kDa和18.8 kDa)和伴花生球蛋白Ⅰ(18.0、16.1 kDa和15.1 kDa)3个组分组成，且亚基出现位置与封小龙等[14]研究报道的较接近。除了上述亚基外，图1中还有其他花生蛋白亚基(33.2、25.6、24.4 kDa)，条带颜色较浅，与Zheng等[15]的研究结果一致。

注：M为标准蛋白；1～21分别对应表1中的花生品种编号。

由图1(A)计算得到的花生蛋白亚基含量如表2所示，花生蛋白亚基含量变异系数见表3。由表2可知：构成花生蛋白的3个组分亚基含量较高；其他亚基(33.2、25.6 kDa和24.4 kDa)含量则较低，分别为(1.70±0.59)%、(1.61±0.43)%和(4.12±1.01)%。另外，花生蛋白亚基组成存在品种差异性。由表3可知，不同亚基的变异系数均在10%以上，其中15.1 kDa亚基含量差异性最大(变异系数为45.53%)，18.8 kDa亚基含量差异性最小(变异系数为11.87%)。研究表明植物蛋白的亚基组成及性质与功能性质有密切关系[16]。王丽[17]研究发现花生球蛋白23.5 kDa亚基(与本研究中的18.8 kDa亚基条带出现位置接近)与花生蛋白溶解性有显著相关性。

表2 21个品种的花生蛋白亚基含量

表3 21个品种的花生蛋白亚基含量的变异系数

由图1(B)计算得到的花生粕亚基含量如表4所示。由表4可知，与花生粕亚基含量相比，提取的花生蛋白65.4、42.1 kDa和40.5 kDa亚基含量(见表2)下降， 16.1 kDa亚基含量明显升高。Sheikh等[18]研究花生蛋白双向电泳发现68 kDa亚基和43 kDa亚基等电点分别为6.3～7.3和5.5～6.3，15.5 kDa亚基的等电点为4.7～5.5。因此，65.4、42.1 kDa和40.5 kDa亚基很大程度受等电点偏离酸沉pH的影响(碱溶pH为11，强碱性环境能够很好地溶解蛋白质)，在提取花生蛋白(碱溶酸沉)的过程中易损失。

表4 21个品种的花生粕亚基含量

2.2 花生蛋白提取率及功能性质分析

21个品种的花生蛋白提取率及功能性质见表5、变异系数见表6。由表5可知，花生蛋白提取率超过80%的有17个品种，其中大白沙的蛋白提取率最高，为93.89%，四粒红的蛋白提取率最低，为71.96%。由表6可知，蛋白提取率的变异系数是7.41%，表明花生蛋白的提取率存在品种差异，这可能与不同花生品种的粗蛋白质含量有关。

从表5可以看出，花生蛋白溶解性为45.32%～78.92%，低于食品加工中常用的大豆蛋白的溶解性(>80%[19])。溶解性变异系数大于10%(见表6)，表明花生品种间的溶解性差异明显。从表5、表6可看出：花生蛋白乳化活性变异系数为14.68%，变幅为34.31～58.50 m2/g，超过50 m2/g的有7个品种，其中冀花4号乳化活性最高(58.50 m2/g)；乳化稳定性变异系数为14.35%，变幅为13.54～23.76 min，超过20 min的仅有2个品种，其中鲁花11的乳化稳定性最高(23.76 min)；起泡能力变异系数为16.62%，变幅为7.00%～14.00%，起泡能力超过10%的品种有7个，其中花育24的起泡能力最强，为14%；泡沫稳定性变异系数为7.60%，变幅为62.50%～85.71%，泡沫稳定性超过80%的品种有11个，其中花育24的泡沫稳定性最强(85.71%)；持水性变异系数为9.85%，变幅为1.89%～2.94%，其中花育24的持水性最好(2.94%)，其次是花育25(2.64%)和冀花2号(2.59%)；持油性变异系数为10.69%，变幅为1.10%～1.67%，其中四粒红、国育2016和白沙的持水性最好(均为1.67%)，其次是拔二罐和天府3号(均为1.64%)。

表5 21个品种的花生蛋白提取率及功能性质

表6 21个品种的花生蛋白提取率及功能性质的变异系数 %

2.3 花生蛋白亚基与蛋白提取率及功能性质相关性分析

采用SPSS软件对花生蛋白亚基与蛋白提取率及功能性质进行相关性分析，结果如表7所示。由表7可知，花生蛋白亚基与蛋白提取率、功能性质均存在相关性，其中16.1 kDa亚基与花生蛋白提取率呈极显著正相关(p<0.01，r=0.559)，而65.4、42.1 kDa亚基和40.5 kDa亚基与花生蛋白提取率呈极显著负相关(p<0.01，r=-0.706；r=-0.581，r=-0.621)。从2.1的研究结果可知，这可能与蛋白亚基等电点有关，蛋白中含有较多等电点接近酸沉pH(pH 4.5)的亚基时，则蛋白提取率较高，反之则蛋白提取率较低。33.2 kDa亚基与花生蛋白溶解性呈极显著正相关(p<0.01，r=0.559)，而18.8 kDa亚基与花生蛋白溶解性呈显著负相关(p<0.05，r=-0.541)，原因可能与蛋白亚基结构有关，研究发现疏松的亚基结构促进分子的伸展，有利于亲水基团的暴露[20]，从而提高水溶性。24.4 kDa亚基与花生蛋白起泡能力呈极显著负相关(p<0.01，r=-0.565)；42.1 kDa亚基与花生蛋白的持油性呈极显著正相关(p<0.01，r=0.627)，这可能与亚基的疏水基团较多有关[21]。综上可知，根据花生蛋白的亚基组成及含量可预示花生蛋白提取率及功能性质，从而为花生蛋白用于具体的食品体系时提供一定的理论基础。

表7 花生蛋白亚基与蛋白提取率及功能性质的相关性分析

3 结 论

以21个品种花生为原料，测定花生蛋白亚基组成及蛋白提取率、功能性质，利用相关性分析指标间关系。结果表明：花生蛋白亚基含量对蛋白提取率及功能性质有明显影响，65.4、42.1、40.5 kDa亚基和16.1 kDa亚基均与花生蛋白提取率呈极显著相关(r=-0.706，r=-0.581，r=-0.621和r=0.559)；33.2 kDa亚基与花生蛋白溶解性呈极显著正相关(r=0.559)，而18.8 kDa亚基与花生蛋白溶解性呈显著负相关(r=-0.541)；24.4 kDa亚基与花生蛋白起泡能力呈极显著负相关(r=-0.565)；42.1 kDa亚基与花生蛋白的持油性呈极显著正相关(r=0.627)。