孕酮对鸡蛋壳品质的影响

张家才，熊铭鑫，张 聪，齐德生

（华中农业大学动物科学技术学院，湖北武汉 430070）

鸡蛋壳是一种生物陶瓷性材料，主要由95% 的碳酸钙和3.5%的基质蛋白组成[1]。蛋壳在子宫中钙化形成，持续约18 h，大致分为3 个关键性的阶段：钙化启动阶段（排卵后6～8 h）、线性沉积阶段（排卵后14～16 h）和钙化末期（排卵后20～22 h）[2]。超微结构研究表明，蛋壳可分为双层壳膜、乳突层、栅栏层、垂直晶体层和角质层[3]。在蛋鸡行业，每年在鸡蛋收集、存储和运输过程中因破蛋而造成的经济损失较大。我国蛋鸡养殖场鸡蛋破损率为10.5%[4]。早期研究表明外源孕酮可以影响蛋壳钙化。如Nys 等[5]在蛋鸡排卵后4 h注射剂量为1 mg/kg 体重（BW）孕酮，蛋壳重显著增加，这表明孕酮促进了蛋壳钙化。但Lundholm 等[6]给蛋鸡口服40 mg/kg BW 孕酮拮抗剂RU38486，使蛋壳厚度增加了12.1%，表明孕酮可能抑制蛋壳钙化。最近的相关研究中，Liu 等[7]研究发现，注射孕酮的蛋鸡产高蛋壳强度蛋的概率大于对照组。相关研究并不能解释这种似乎矛盾的现象。

在一个产蛋循环中，血液孕酮含量在排卵前的4～6 h达到最高[8]，促进卵巢排卵，此时子宫中的蛋壳钙化处于钙化末期，且未有研究表明此孕酮峰值与蛋壳钙化有关。除了孕酮峰值，血液孕酮在排卵后1～5 h 的含量也高于其他钙化时期的基础水平[9]。因此，本研究提出假设孕酮在排卵后1～5 h 可能影响蛋壳钙化。为了验证这一假设，本研究用不同剂量的孕酮在排卵后的1～5 h 注射蛋鸡，检测蛋壳品质，探究孕酮对蛋壳品质的影响。

1 材料与方法

1.1 试验设计 挑选蛋壳强度在25～35 N 的40 周龄海兰褐蛋鸡72 只，随机分为6 组，每组12 只鸡，单笼饲养。自由采食和饮水。日粮原料组分和营养成分见表1。每天05:00—17:00 观察每只蛋鸡的产蛋时间并记录，连续观察10 d，用于推测准确的排卵时间（产蛋后约30 min内排卵）。根据推测的排卵时间，分别于排卵后1、2、5 h 腿肌注射不同剂量的孕酮：排卵后5 h，孕酮注射剂量分别为0.00（对照）、1.00（处理1）、0.25 mg/kg BW（处理2）；排卵后2 h，孕酮注射剂量分别为0.25（处理3）、0.15 mg/kg BW（处理4）；排卵后1 h，孕酮注射剂量为0.15 mg/kg BW（处理5）。试验用孕酮标准品购自Sigma 公司，用花生油溶解配制使用。

1.2 测定指标及方法

1.2.1 蛋壳强度与厚度 孕酮处理后第2 天上午收集各组所产鸡蛋。各组随机挑选8 个鸡蛋用于检测蛋壳品质。用蛋壳强度测定仪（EFG-0503，日本）检测蛋壳强度。检测时鸡蛋尖端朝下，钝端朝上。用螺旋测微器分别测定蛋壳尖端、钝端和赤道区域的厚度，计算出平均值作为蛋壳厚度。

表1 日粮原料组分及营养成分

1.2.2 蛋壳超微结构 用扫描电子显微镜（JSM-6390LV，日本）扫描蛋壳横断面的超微结构。手动打破鸡蛋，用蒸馏水洗净内表面残留的蛋清和外表面的污垢。按Kaplan 等[10]报道的方法去除壳膜。室温下干燥后，取鸡蛋赤道区域约1 mm2的长方形蛋壳碎片，横断面朝上固定于粘贴板上。喷金后用于观察蛋壳超微结构。

1.3 统计分析 用SPSS 20.0 统计并分析数据，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），并用Duncan´s 法分析组间的差异显著性，以P＜0.05 为差异显著标准。结果均以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 孕酮对蛋壳强度的影响 由图1 可知，处理1 均产破壳鸡蛋，处理2 产部分破壳和部分蛋壳完好的鸡蛋，因此处理1 和处理2 的蛋壳强度无法测定。处理1 和处理2 中，孕酮抑制了蛋壳钙化，且蛋壳表面发白。表2数据显示，与对照组相比，处理1 和处理2 的蛋壳厚度显著降低；处理3 和处理5 蛋壳强度和厚度无显著变化；处理4 的蛋壳强度和蛋壳厚度显著增加。结果表明，孕酮对蛋壳品质的影响与注射时间和剂量均密切相关。

2.2 孕酮对蛋壳超微结构的影响 处理1 和处理4 的鸡蛋表观差异最为显著，更能显示孕酮对蛋壳的影响，故选择对照组、处理1 和处理4 的鸡蛋壳进行超微结构分析。由图2 和表3 可见，与对照组相比，处理1 的有效层厚度显著降低，乳突层和乳突小体宽无显著变化；处理4 的有效层厚度显著增加，乳突层厚度和乳突小体宽均显著降低。结果表明，孕酮通过改变蛋壳的超微结构而影响蛋壳品质。

3 讨 论

表3 孕酮注射对蛋壳超微结构的影响 µm

从排卵到形成鸡蛋产出需要24～25 h。排卵后约6 h鸡蛋进入子宫，开始钙化。在这一循环内，血液孕酮含量呈规律性波动[11]。关于孕酮对鸡蛋壳品质影响的报道较少。赵海旋[12]报道，在蛋进入子宫45 min 和15 h时，注射1 mg/kg BW 孕酮会使蛋壳厚度极显著增加；而子宫部钙结合蛋白（CaBP-D28k）、钙离子ATP 酶（Ca2+-ATPase）和碳酸酐酶（CA）基因的表达量均显著降低。叶幼荣[13]研究结果表明，蛋壳钙化时，孕酮抑制了子宫的Ca2+转运和CaCO3的形成。这在细胞试验上也得到了验证。Bar[14]在蛋鸡产蛋后2～3 h 注射1 mg/kg BW 孕酮，Ca2+转运效率和CaBP-D28k 的mRNA 水平显著降低。这与赵海旋[12]研究结果一致，表明孕酮可以抑制子宫Ca2+转运而影响蛋壳形成。但这不能解释赵海旋[12]研究中蛋壳厚度极显著增加的现象。

蛋壳品质与其超微结构有关[15]。乳突层越小、乳突小体宽越小和有效层厚度越大，蛋壳强度越大[16]。超微结构主要由基质蛋白调节，如OC-116、OC-17 蛋白等[17-18]。蛋壳钙化时，OC-17 结合无定型CaCO3，形成晶体沉积到蛋壳表面[19]。而CaCO3晶体的形态和沉积方向受卵转铁蛋白（OVO）和卵清蛋白（OVA）调节[2]。本研究中，处理1 和处理4 蛋壳超微结构均发生显著变化，表明孕酮可能通过影响蛋壳乳突层结构和有效层厚度来改变蛋壳品质。乳突层结构与基质蛋白OCX-32 有关[20]。孕酮是否可以调节OCX-32基因的表达，还需进一步研究。

本研究在排卵后1～5 h 分别给蛋鸡注射不同剂量孕酮，处理1 和处理2 蛋壳品质显著降低，处理3 和处理5 蛋壳品质无显著变化，处理4 蛋壳品质显著增加，表明孕酮对蛋壳钙化的影响与注射时间和剂量有关。这可以解释早期相关研究结果中的不一致。Wells[21]研究表明，孕酮在体内代谢较快，半周期为16～18 min。孕酮促进可调节蛋壳超微结构的蛋白OVA和OC-17基因表达[13]。结合本试验结果和已有的研究报道，推测孕酮对蛋壳钙化的影响可能存在2 种机制：①孕酮既抑制子宫的Ca2+转运和CaCO3的形成，同时也促进了可以调节蛋壳超微结构的调节蛋白（OVA、OC-17）的表达。在接近蛋壳钙化启动时，注射剂量较高的孕酮使血液孕酮在钙化启动时含量任然较高，抑制子宫内CaCO3的形成，导致钙化无法正常进行（处理1、2）。与之相反，在远离钙化启动时，注射低剂量孕酮，使血液孕酮在钙化启动时回复正常，CaCO3正常形成，又由于孕酮促进了调节蛋白（OVA、OC-17）的表达，形成的蛋壳结构更加致密，蛋壳强度增加（处理4）。②孕酮可能改变壳膜的成分或结构，改变壳膜上的CaCO3晶体的成核位点而影响钙化初期乳突层的形成。壳膜在排卵后3～4 h 形成，其结构与成分也影响蛋壳强度[22]。壳膜上的成核位点影响蛋壳乳突层结构。

4 结 论

本研究结果表明，孕酮可以影响蛋壳强度、蛋壳厚度和蛋壳超微结构，对蛋壳品质有抑制和促进双重调控作用，其影响与剂量和注射时间有密切关系。这表明孕酮对蛋壳调控可能存在2 种机制。