植物提取物在家畜精液冷冻保存中的研究与应用进展

张美娜，郭富强，王瑞军*，李金泉,2*

（1.内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.农业部肉羊遗传育种重点实验室，内蒙古自治区动物遗传育种与繁殖重点实验室，内蒙古自治区山羊遗传育种工程技术研究中心，内蒙古金莱牧业科技有限责任公司，内蒙古呼和浩特 010018）

精液冷冻保存过程中，由于精子膜中的多不饱和脂肪酸会产生较多的活性氧，促使精浆中的抗氧化剂与促氧化剂之间的平衡被破坏，氧自由基浓度增加，引起精子的氧化应激反应，造成精子活力下降、细胞膜和DNA 完整性受损，使精子授精能力降低，母畜受胎率减少。精液冷冻保存过程中，主要受温度变化、细胞内外冰晶的形成和活性氧含量的影响。这些因素会改变精子细胞膜的通透性、改变蛋白的迁移速度，改变水和糖以及电解质的渗透性等[1]。精子在冷冻保存过程中形成的冰晶会损伤细胞器和细胞膜、改变膜结构和膜完整性、改变线粒体膜电位和释放活性氧。活性氧由精子代谢产生，是精子成熟、获能和顶体反应所必需的物质[2]。正常情况下，精液中产生的活性氧与精浆的抗氧化能力保持相对平衡的状态。活性氧过量时，会与精子膜上的不饱和脂肪酸反应，产生脂质过氧化物（LPO），降低精子活力，损伤质膜完整性以及降低精子的授精能力。

为减少精液冷冻保存过程中产生多余的活性氧，在稀释液中添加抗氧化剂是解决途径之一。目前在精液冷冻保存稀释液中添加植物性提取物作为抗氧化剂成为研究的热点。本文主要从迷迭香提取物、茶多酚、红景天多糖、葡萄籽原花青素、竹叶黄酮、白藜芦醇、番茄红素和槲皮素在动物精液冷冻保存上的应用与研究进行综述。

1 迷迭香提取物

迷迭香（Rosmarinus Acheinalis L）是一种天然抗氧化剂，产于地中海，在我国各地都有种植，属于药用植物，其叶片与花可以提取抗氧化物质。迷迭香提取物中起抗氧化作用的主要成分是肌酸、肌醇和迷迭香酸等[3]，可以清除氧自由基和防止脂质过氧化反应。其中迷迭香酸和香豆酸含量较高，而迷迭香酸是咖啡酸和3，4-二羟基苯乳酸酯，具有显著的抗氧化作用和消炎作用[4]，能够降低精液冷冻过程中对精子膜的损伤。香豆酸的抗氧化性是由于结构式中存在邻苯二酚，可以防止脂肪酸和甘油三酯发生氧化反应[5]，当清除活性氧时，香豆酸可以产生多种二次抗氧化剂，构成有效的防御机制[6]。由于其抗氧化作用，被用作食品添加剂，改善食品保存时间[7]。

Daghighkia 等[8]在牛精液冷冻稀释液中加入迷迭香提取物与谷胱甘肽，发现解冻后精子活力与膜完整率有所提高，单独添加10 g/L 的迷迭香提取物有助于维持牛精子的总活力和平均路径速度。迷迭香提取物与谷胱甘肽结合可能保护精子细胞脂质、蛋白质以及细胞膜的其他结构化合物，以抵抗低温的损伤[9]。Malo 等[10]研究发现，猪精液冷冻稀释液中添加迷迭香提取物提高了解冻后精子的质量。Borghei-rad 等[11]研究发现，在饲料中添加迷迭香叶粉能显著提高精液质量和活力。Motlagh 等[12]在含大豆卵磷脂基稀释液中添加迷迭香提取物，解冻后发现绵羊精子的质量与添加迷迭香提取物的剂量有很大关系。

2 茶多酚

茶多酚是从茶叶中提取的多酚物质，占干茶叶可提取固体物质的30%～40%，利用水、乙醇、甲醇和丙醇进行提取茶多酚[13]，该物质对活性氧自由基具有一定的保护作用，是一种有效的抗氧化剂，能提高动物精子解冻后的活力与活率。茶多酚具有抗炎、抗突变和抗癌等作用[14]。茶多酚可以通过直接清除活性氧或螯合金属离子，间接提高抗氧化酶的活性[15]。多酚类化合物容易被脂质双分子层和各种细胞膜受体吸收，可以防止冷冻-解冻后精子膜的损伤[16]，因精子膜吸收茶多酚，从而防止自由基诱导脂质过氧化反应影响精子质量。

Kitaji 等[17]研究发现，在猪精液冷冻保存过程中添加0.01%的茶多酚可以防止解冻后精子膜的损伤，对猪精子起到一定的保护作用。Mehdipour 等[18]研究发现，在含大豆卵磷脂的稀释液中添加茶多酚可以有效防止绵羊精子细胞受免氧化应激损伤。黄明光等[19]通过对猪精液冷冻保存的研究时发现，在稀释液中添加0.04 g/L 的茶多酚能有效提高精液解冻后质量。Parameswari 等[20]研究发现，在兔子精液冷冻保稀释液中加入茶多酚后精子活力和形态较好，且精子DNA 损伤较少。目前，该抗氧化剂大部分用于跟人类有关的疾病，在动物精液冷冻保存中研究较少。

3 红景天多糖

红景天（Rhodiola sachalinensis A.Bor）属于十字花科植物，生长在海拔1 600～4 000 m，该物质中主要的活性成分包括红景天多糖、山奈酚等[21]。红景天多糖是从红景天根中提取出来的物质，该物质具有抗氧化、抗炎和DNA 修复等作用[22]，能有效清除超氧阴离子自由基，防止脂质过氧化反应[23]，因此红景天多糖作为抗氧化剂在许多研究中得到应用，但对哺乳动物精液冷冻保存过程中产生的抗氧化性能未得到评价。

张树山等[24]评估不同浓度的红景天多糖对解冻后猪精子质量的影响发现，在精子冷冻稀释液中添加6 mg/L红景天多糖解冻后猪精子运动性有明显改善，丙二醛含量有显著变化。席利萌等[25]研究发现，在稀释液中添加红景天多糖可以显著提高冷冻后奶山羊精子的质量和抗氧化能力。王晓东等[26]发现，红景天多糖能显著降低大鼠肝细胞中丙二醛含量。Yang 等[27]研究发现，在猪精液冷冻稀释液中添加红景天多糖可降低精子的损伤程度。Zhao 等[28]实验发现，在不含甘油的稀释液中添加红景天多糖的丙二醛含量降低效果比在含甘油的稀释液中添加红景天多糖更明显。Cao 等[29]在牛精液冷冻保存稀释液中添加0.06 mg/mL 的红景天多糖，发现解冻后精子活力和膜完整率有所提高。

4 葡萄籽原花青素

我国葡萄产量及种植面积位居世界首位，葡萄在酿酒的过程中会产生副产物，葡萄籽便是其一。葡萄籽含有较高的生物类黄酮、维生素C、维生素E 和原花青素等，可以调节细胞氧化损伤，改善氧化剂和抗氧化剂之间的平衡[30]，这些有效成分可以起到一定的抗氧化作用。葡萄籽原花青素是天然的食品抗氧化剂，该物质通常是亲水性的多羟基衍生物。原花青素在水果、蔬菜和茶叶以及许多植物（包括葡萄和苹果）的种子中含量很高[31]。葡糖籽原花青素已被证明具有广泛的药理和生化作用，其主要的作用是抗氧化。葡糖籽原花青素是一种有效的自由基清除剂，比维生素效果要好[32]。

孙艳青等[33]在猪精液冷冻保存稀释液中添加40 μg/mL的葡萄籽原花青素，发现解冻后精子活力、顶体完整率、线粒体活性和质膜完整性都有所提高。Hassan 等[34]研究大鼠睾丸疾病时加入葡萄籽原花青素，发现该物质可以抑制氧化应激和内源性抗氧化系统对睾丸功能产生不良影响。通过分析活性氧的产生、凋亡和线粒体功能障碍，可进一步探讨葡萄籽原花青素保护作用的氧化机制。

5 竹叶黄酮

竹子为多年生禾本科竹亚科植物，主要的抗氧化成分为竹叶黄酮，不同部位的提取物具有不同的抗氧化活性，例如竹叶提取物的抗氧化性要高于竹子茎部提取物[35]。竹叶黄酮是从竹子中提取出来的生物类黄酮，是一种高效的抗氧化剂，它既可以将脂肪氧化的链式反应阻断，又可以与多种金属离子发生螯合反应[36]。竹叶黄酮的抗自由基活性很强，能清除多种活性氧自由基，抑制脂质过氧化反应，减少丙二醛的生成[37]。这种抗氧化剂是近几年被我国卫生部认证为新型天然抗氧化剂，已被广泛用于各种食品添加剂中，但在动物精液冷冻保存中应用较少。

杨威[38]研究发现，猪精液冷冻保存稀释液中加入5 mg/mL 的竹叶黄酮能有效提高解冻后精子的质量。丘富安等[39]研究发现，黄酮类物质能够显著提高精子抗氧化能力，使超氧化物歧化酶的活性有所提高，降低丙二醛生成量。

6 白藜芦醇

白藜芦醇是一种非黄酮类多酚，比维生素E 和C 具有更强的抗氧化活性，并且毒性较低[40]，主要存在于葡萄中，具有抗氧化、抗癌、抗衰老、抗炎、保护心脏和神经的作用[41]。白藜芦醇可以抑制精子氧化应激反应，在动物精液冷冻保存过程中研究较多。目前在动物模型中进行的研究结果表明，白藜芦醇通过刺激下丘脑-垂体性腺轴促进大鼠精子的产生，且不引起副作用[42]。白藜芦醇对人和小鼠精子自由基所致的脂质过氧化反应和DNA 损伤也有保护作用，对动物精子产生多余的活性氧有清除作用[43-44]。

Gadani 等[45]研究发现，在猪精液冷冻保存稀释液中添加2 mmol/L 的白藜芦醇可以显著提高解冻后精子的授精能力。刘程[46]研究发现，在牛精液冷冻保存稀释液中添加150 μmol/L 白藜芦醇可以降低精子膜的损伤和保护精子DNA 的完整性。Longobardi 等[47]在水牛精液冷冻保存中，添加50 μmol/L 的白藜芦醇可以降低水牛精子的获能反应和氧化应激反应，提高膜的稳定性和体外授精能力。Eva 等[48]观察白藜芦醇对牛精子5 个不同时期的体外抗病毒、抗炎和抗氧化作用时，发现在培养液中加入5～50 μmol/L 白藜芦醇可以提高精子活力，防止精子在体外发生氧化应激反应。

7 番茄红素

番茄红素是番茄中最丰富的类胡萝卜素，被认为是最有效的抗氧化剂。该物质在精子细胞中发挥抗氧化作用，是将本身所带电子传递给氧自由基，氧自由基与之相结合，在损伤精子细胞之前超氧阴离子被中和，进而保护精子细胞不被损伤[49]。在精液冷冻保存过程中，能使精子细胞和组织免受脂质过氧化的有害影响，延长精子的存活时间。番茄红素的作用机制涉及单重态分子氧的猝灭和过氧自由基的捕获[50]。在精液冷冻稀释液中添加番茄红素可以减少丙二醛的生成量，意味着番茄红素可以降低精子细胞的氧化作用。

梁作文等[51]报道，在冷冻稀释液中添加适当浓度的番茄红素可以降低冷冻-解冻过程中活性氧对精子线粒体和精子质膜的氧化损伤，提高精子的抗凋亡能力。Peker 等[52]研究发现，在精子冷冻稀释液中联合添加番茄红素与半胱胺酸可以提高绵羊精子活力、线粒体活性和氧化应激等参数。Lian 等[53]试验发现，在精液冷冻保护剂中添加适当的番茄红素可减轻冻融过程中对精子线粒体的氧化损伤，减轻活性氧对精子质膜的氧化应激损伤，提高精子的抗凋亡能力。

8 榭皮素

榭皮素是一种类黄酮抗氧化剂，能够有效清除活性氧和羟自由基，使解冻后精子质量有所改善[54]。槲皮素是通过酶和非酶系统抑制活性氧而产生较强的抗氧化性，尤其是NADPH 氧化酶和NADH 还原酶。目前已经发现槲皮素可以抑制精子中的糖降解途径，防止精子磷酸化和提高精子解冻后质量[55]。槲皮素具有螯合金属物质和保护精子DNA 完整性的能力[56]。

有研究报道，将槲皮素添加在牛、马、羊、猪精液冷冻保存稀释液中，解冻后对精子细胞具有一定的保护作用[57]。Banday 等[58]研究发现，在羊精液冷冻保存稀释液中添加槲皮素、牛磺酸和还原性谷胱甘肽的效果无显著性差异。Avdatek 等[59]研究发现，在牛精液冷冻保存稀释液中添加25 μg/mL 榭皮素可对精子DNA 完整性有积极影响，而对精子渐进运动没有不良影响。Filho 等[60]研究马精液冷冻保存时发现，在稀释液中添加槲皮素并不能影响精子渐进运动能力、线粒体功能、顶体和质膜完整性等。Yoshimoto 等[61]研究发现，榭皮素能降低精子冷冻保存过程中线粒体膜电位，从而精子诱导获能。目前榭皮素的抗氧化性还需要进一步研究。

9 小 结

精液冷冻保存过程中，由于精子膜中含有不饱和脂肪酸会产生活性氧，过多的活性氧会对精子造成氧化损伤。在精子冷冻稀释液中添加一定量的抗氧化剂，可以消除多余的活性氧，延长精子的存活时间、提高精子的活率和降低丙二醛含量。植物提取物是从植物中提取的一种高效的抗氧化剂，该物质毒性较低，便于取材，主要的抗氧化成分为黄酮类物质及其衍生物、酚类物质和肌酸类物质等，可以有效清除精子代谢产生的活性氧。将植物提取物用于精液冷冻保存，可有效提高解冻后精液品质，为精液氧化损伤机理研究提供一定的理论基础。目前，植物提取物本身也存在一些问题，例如提取过程中可能会有农药的残留，影响后续试验。另外，受提取温度的影响，也会导致一些有效物质受热降解等。植物不同部位的提取物抗氧化性也不同，有效成分含量存在差异。因此，植物提取物的工艺有待不断完善，进而提高植物提取物纯度和应用的稳定性和可靠性。