lncRNA 在卵母细胞成熟过程中作用的研究进展

焦亚飞，刘树林，叶 升，石德顺，黄 奔

（广西大学动物科学技术学院，亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁 530004）

在人的基因组文库研究中，通过高通量测序技术已经揭示了人类基因组文库，并且在其中发现了大量非编码基因[1]。非编码RNA 根据其长度可以分为小RNA和lncRNA，它曾被认为是基因转录过程的“噪音”，是RNA 聚合酶Ⅱ转录的副产物。在lncRNA 的研究中发现，相比编码蛋白的基因，lncRNA 更具有组织特异性，且lncRNA 在表观遗传调控、转录以及转录后的修饰都发挥着重要的功能[2]。有关lncRNA 的研究已经发表论文超过3 000 篇，涉及细胞分化、个体发育、人类疾病（如阿尔兹海默症、癌症等）研究领域[3-6]。

卵母细胞是生殖医学、细胞生物学、物种保护等领域的重要研究对象，与雄性配子不同，卵母细胞可以在体外培养成熟[7]。卵母细胞体外成熟的质量对卵母细胞的孤雌激活、体外受精、核移植、胞质注射等胚胎发育具有重要影响。然而，体外成熟的卵母细胞与体内成熟的卵母细胞相比，存在着核质成熟不同步、囊胚率低、多精受精率高等问题。探究卵母细胞体外成熟存在的问题，需要了解卵母细胞成熟过程中的调控机制，尤其是通过高通量测序技术探究卵母细胞成熟过程中RNA 表达情况，这一技术已经在生物学研究领域广泛应用。通过转录组测序发现，lncRNA 参与卵母细胞成熟过程中的各个阶段。本文综述了动物繁殖相关lncRNA 的研究进展，以期通过lncRNA 的调控作用解释卵母细胞成熟过程中存在的问题，为深入探究家畜繁殖机制提供理论基础。

1 lncRNA 的作用机制及生物学功能

1.1 lncRNA 的作用机制 lncRNA 作为基因表达调控的关键因子，通过不同方式对基因进行调节[8]，其作用机制主要有5 种形式：①lncRNA 可以作为信号分子与转录因子相紧密结合，或在特定时间和空间上通过信号通路调控基因表达；② lncRNA 可以作为诱导分子阻碍转录因子与其他蛋白类物质、染色体相结合或是阻碍蛋白因子与细胞核相结合，如lncRNA 可以与miRNA 相结合；③lncRNA 作为引导分子引导染色质修饰酶或目的基因，通过顺式或反式结构与远距离靶基因相结合；④lncRNA 可以作为支架分子使许多复杂的蛋白质形成核糖体蛋白复合物，这种复合物可以在染色质中影响组蛋白修饰；⑤ lncRNA 也可以作为增强子，起到启动子与增强子之间连接蛋白的作用。

1.2 lncRNA 的生物学功能 根据lncRNA 的调控方式可以将其在生物学上的功能分为表观遗传调控、转录调控及转录后调控3 种层面[9]：①表观遗传调控，lncRNA 可以通过募集染色质重塑复合物结合至特定基因位点，在转录前发挥基因的调控作用；②转录中调控，lncRNA 可以对控制蛋白编码基因的启动子进行直接或间接的调控，这类lncRNA 可能会与基因转录蛋白相结合，从而影响转录调控过程，lncRNA 也可以调节转录因子活性，对靶基因的表达产生影响；③转录后调控，lncRNA 可以通过碱基互补配对原则对蛋白转录调控的基因进行加工和修饰。此外，lncRNA 也可以像ceRNA（competing endogenous RNA）结合miRNA 的作用方式，对靶基因的转录过程进行调控[10]。

2 lncRNA 对动物卵母细胞成熟的调控

卵母细胞成熟质量对受精和胚胎发育的潜力具有重要作用。目前体外成熟的卵母细胞质量低于体内成熟的卵母细胞，应用高通量测序技术对体外成熟卵母细胞进行基因组测序，发现成熟过程中存在大量差异表达的lncRNA，表明lncRNA 与卵母细胞成熟具有潜在联系[11]。lncRNA 广泛参与卵母细胞成熟的生物学过程，在卵丘颗粒细胞扩展、激素水平、卵母细胞核质成熟方面发挥着重要的调控作用。

2.1 lncRNA 参与卵丘颗粒细胞扩展的调控 卵丘细胞对卵母细胞的成熟起到至关重要的作用，卵丘细胞主要通过胞质磷酸化、去磷酸化、氨基酸摄入以及相关第二信使IP3、cAMP 作用来调节卵母细胞成熟，同时卵丘细胞的扩展也可以减少成熟分裂的抑制因子，从而解除其对卵母细胞减数分裂阻滞的束缚[12]。

Bouckenheimer 等[13]利用转录组测序技术分析发现人卵母细胞周围的卵丘细胞为卵母细胞运输大量的营养和物质，包括mRNA 和lncRNA，表明lncRNA 通过卵丘细胞对卵母细胞的成熟具有重要作用。研究表明，质量差的人卵丘卵母细胞复合体中显著下调的基因lncRNA-Y00062参与对靶基因NEK7 的调控[14]，而NEK7 是一个在纺锤体组装和有丝分裂过程中发挥重要作用的基因，表明lncRNA-Y00062对卵母细胞成熟具有调控作用[15]。Warzych 等[16]研究也发现，lncRNAENST00000502390在质量差的卵丘细胞复合体中表达量高，其与超长链脂肪酸延伸酶5（Elongation of Very-Long-Chain Fatty Acids Protein5，ELOVL5）共同参与调节卵母细胞成熟及排卵过程的发生。

通过多人多囊卵巢综合征（Polycystic Ovary Syndrome，PCOS）的卵丘细胞复合体的研究揭示了lncRNA 对卵母细胞转录的调控关系。Xin 等[17]选取XLOC_011402、ENST00000454271、ENST00000433673、ENST00000450294、ENST000004324315 个差异lncRNA采用QRT-PCR 对芯片结果进行验证，结果发现许多差异表达的lncRNA 都是从2 号染色体转录而来，可能作为增强子调控其临近的蛋白编码基因。与正常女性相比，PCOS 患者的卵丘细胞中有623 个lncRNA 和260 个mRNA 显著上调或下调，提示PCOS 患者和正常女性中lncRNA 的差异表达可能是PCOS 发生的原因之一，可能影响卵母细胞发育[17]。

Yerushalmi 等[18]在紧凑型和扩张型卵丘细胞之间鉴定了1 746 个差异表达基因，这些基因大多参与细胞生长、细胞间信号传导和相互作用及细胞外基质和类固醇生成；在差异表达的基因中，发现89 个长链非编码RNA，其中12 个lncRNA 参与颗粒细胞发育过程的基因内含子中，其中整合素α6 反义RNA（Integrin Alpha6 Antisense RNA，ITGA6-AS）的表达在MII 期卵母细胞-放射冠-卵丘复合体（Oocyte-Corona-Cumulus Complex，OCCC）的卵丘细胞中显著上调，而其靶基因ITGA6则显著下调。整合素α6β1 是颗粒细胞层黏连蛋白的受体，它们在颗粒细胞中的相互作用能够增强细胞的存活和增殖能力并调节类固醇生成[19]。但ITGA6-AS是否直接调节ITGA6目标基因的表达需要进一步研究。Yerushalmi 等[18]实验表明，lncRNA 转录可能有助于调节卵丘的扩张和卵母细胞的成熟。

2.2 lncRNA 参与激素水平的调控 激素对卵母细胞成熟、受精以及胚胎发育都起着重要的促进作用。绝大多数卵母细胞成熟培养体系中都会添加各种激素。Singh等[20]研究发现，猪卵母细胞成熟体系中加入雌二醇（E2）和卵泡刺激素（FSH）可降低胚泡损伤率。

抗缪勒氏激素（AMH）对哺乳动物雄性分化过程中缪勒氏管的退化起重要作用，主要作用于成年动物卵巢颗粒细胞、睾丸支持细胞和间质细胞[21]。AMH 的特异性作用是通过其受体AMH II 型受体（Amhr2）发挥的，但Amhr2基因被特异性激活的机制尚不完全清楚。Kimura 等[22]在卵巢颗粒细胞和睾丸支持细胞中发现了一种长链非编码RNA-lncRNA-Amhr2，是从Amhr2基因上游转录而来的，在原代颗粒细胞中，lncRNAAmhr2的下调导致Amhr2messnger RNA 水平下降，瞬时报告基因检测显示，lncRNA-Amhr2激活增加了Amhr2启动子活性，该活性与lncRNA-Amhr2在小鼠颗粒细胞稳定转染的OV3121 细胞中的转录有关。此外，通过Tet-on 系统，lncRNA-Amhr2转录的诱导显著提高了OV3121 细胞中Amhr2启动子活性。这些结果表明，lncRNA-Amhr2通过增强启动子活性，在卵巢颗粒细胞的Amhr2基因激活中发挥作用。脯氨酰寡肽酶（Prolyl Oligopeptidase，POP）是一种能特异性水解多肽链中脯氨酸残基羧基端肽键的丝氨酸蛋白酶，POP参与肽类激素和神经肽的成熟与降解[23]。Matsubara等[24]比较了小鼠POP 的基因组序列，在相邻的基因间发现6 个保守的非编码序列（Conserved Non-Coding Sequences，CNSs），从这些CNSs 中转录出4 个长链非编码RNA，其中LncPrep+96kb 的表达模式与POP的表达模式相关。lncPrep+96kb 由于转录起始位点的不同而被转录为2 种形式，定位于细胞核和细胞质中，但细胞核中存在较多的lncPrep+96kb。当将lncPrep+96kb敲入小鼠卵巢原发性颗粒细胞和肝细胞时，2 个细胞的POP 表达均下降，相反，lncPrep+96kb 的过表达仅在颗粒细胞中增加了POP 的表达，由于lncPrep+96kb在激素处理的卵巢中上调的时间与POP 相同，表明lncRNA 可能在颗粒细胞的POP 基因激活中发挥作用，通过一些激素的合成从而影响了卵母细胞的成熟[24]。

Liu 等[25]通过PCOS 患者和健康女性的GCs 的转录组表达谱分析，发现lincRNA HCG26在POCS 患者的卵巢颗粒细胞中呈高表达，其表达水平与卵巢窦卵泡数相关，通过在人卵巢颗粒细胞系KCN 中下调HCG26的表达抑制了细胞增殖，增加芳香化酶基因表达和E2的产生，提示lincRNA HCG26可能在调控PCOS 颗粒细胞增殖和卵泡生长具有重要作用。

2.3 lncRNA 参与卵母细胞核质成熟的调控 在整个卵母细胞成熟过程中，涉及的过程主要可以分为细胞质成熟和细胞核成熟。细胞质成熟主要包括细胞器的形态、卵母细胞骨架以及成熟过程中需要的RNA 转录和蛋白合成；核成熟主要包括生发泡破裂、染色体复制、同源染色体分离等过程[26]。

Karlic 等[27]研究发现，lncRNA 在卵母细胞成熟过程中同样发挥巨大作用，卵母细胞内含有休眠状态的lncRNA，当mRNA 在卵母细胞内发挥转录功能、调控细胞质聚腺苷酸化时，可以激活卵母细胞内的lncRNA，lncRNA 在促进细胞质聚腺苷酸化的过程中表现为与mRNA 协同状态，因此lncRNA 可能在调控卵母细胞成熟尤其是胞质成熟方面发挥重要作用。Bouckenheimer 等[28]分析了公开可用的RNA 测序数据库，以识别在减数分裂中期（MII）卵母细胞（BCAR4、C3orf56、TUNAR、ooeg-as1、CASC18和LINC01118）和卵丘细胞（NEAT1、MALAT1、ANXA2P2、MEG3、IL6STP1和VIM-AS1）中大量存在的lncRNA，这些数据通过使用独立卵母细胞和卵丘细胞的QRT-PCR 分析得到验证。通过构建lncRNA-mRNA 共表达网络，预测所鉴定的lncRNA 的功能。这一分析表明MII 期卵母细胞lncRNA 可能参与染色质重构和驱动胚胎早期发育。

果蝇Oskar（Osk）mRNA 具有不同寻常的编码和非编码功能。Osk是一种信使RNA，它编码1 种蛋白，这种蛋白特别表达于卵母细胞的后部。这种空间受限的部署依赖于mRNA 的定位程序以及翻译的抑制和激活，所有这些都依赖于主要位于mRNA 的3' untranslation region（UTR）的调控元件[29]。3' UTR 还介导了Osk的非编码功能，招募各种调控因子影响卵子形成后期极性的建立，这对卵母细胞发生的进展至关重要[30]。在哺乳动物中还没有发现类似果蝇Osk的lncRNA，因此在哺乳动物中可能存在类似的lncRNA 在卵子发生过程中起着重要的作用。

3 展 望

lncRNA 是调控生殖细胞命运和功能的一类重要基因。目前与繁殖有关的lncRNA 的研究处于初始阶段，lncRNA 的作用及机制不断被发现。已有研究开始逐步揭示lncRNA 在卵泡发育、卵母细胞成熟、早期胚胎发育过程中的调控作用，研究主要积集中于人和小鼠方面，与大动物繁殖相关的lncRNA 的功能和机制还处于未知状态，还需要不断地深入研究和完善。通过模式动物的lncRNA 相关研究，将为家畜繁殖的机制和优化家畜繁殖力提供理论参考。