生物钟对哺乳动物生理代谢、繁殖和肠道菌群影响的研究进展

马 骁，马 慧，李锡智，张 鲁，刘国世*

（1.中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193；2.北京首农畜牧发展有限公司，北京 100076）

生命已经适应了由地球自转所控制的能量周期，通过进化分子机制来预测一天中生命活动最有利的时间。因此，大多数生物功能表现为日常节律。在人类和大多数哺乳动物体内，这些昼夜振荡是由称为生物钟的自我调节性转录和翻译反馈回路引起的。生物钟不仅能够调节睡眠、饮食，还调控着激素、体温、血压以及其他生理生化指标的节律性周期变化。从生物节律的角度探究生物钟对宿主能量代谢、繁殖性能和肠道菌群的影响，可以为研究哺乳动物繁殖障碍性疾病、代谢性疾病、免疫性疾病、退行性疾病等提供新的思路。本文重点论述了生物钟和新陈代谢之间的相互关系、生物钟通过褪黑素介导下丘脑-垂体-性腺轴影响动物的繁殖性能，以及肠道菌群的稳态。

1 生物钟系统

生物钟又称生理钟，是生物体生命活动的内在节律，由生物机体内的时间结构序所决定。哺乳动物下丘脑中的视交叉神经上核（Suprachiasmatic Nucleus，SCN）是整个机体的核心生物钟系统，在机体水平上起着中枢起搏器的作用。目前研究普遍表明，SCN 起到同步外周组织的生物钟系统的作用[1]。SCN 神经元通过视网膜下丘脑束接受来自于视网膜内表达特殊黑视素的神经节细胞的光信息，感知外界环境的昼夜变化，并使其生物钟的相位与光的相位同步。体外移植的SCN能够在许多天内维持明显的昼夜节律，而外周组织虽然在移植时具有节律性，但节律性较差，持续时间较短。这表明，外周组织的生物钟需要持续的引导才能保持同步。此外，当SCN 被去除后，大部分体外培养的组织或细胞中相关基因的表达仍呈现出节律性。这就进一步说明，SCN 的作用是引导外周组织细胞的节律，使其呈现同步化，但并不产生节律[2]。光照的变化影响SCN 自由性节律振荡，SCN 进而调控机体的行为及代谢的节律性振荡，该过程分为输入信号的变化（Input）、核心生物钟系统的节律性振荡（Oscillator）、机体的输出机制（Output）[3]3 个步骤。

2 生物钟系统的分子机制

在分子水平上，转录因子脑和肌肉ARNT 样蛋白1（Brain And Mascle ARNT Like Protein 1，BMAL1）和CLOCK 蛋白或NPAS2（Neuronal PAS Domain Protein 2）蛋白在昼夜节律早期发生异源二聚，与基因启动子的E-box 元件结合，诱导下游基因转录。PER基因和CRY基因通过编码BMAL1:CLOCK/NPAS2 的抑制因子诱导下游基因转录。在昼夜节律的夜晚，PER 和CRY 转移到细胞核，形成大的复合体。这抑制BMAL1:CLOCK/NPAS2 的转录活性，从而下调了它们自身的表达。PER和CRY 蛋白的降解能够解除转录抑制，使得1 个周期约为24 h 的转录周期重新开始[4]。

REV-ERB 又称核受体亚家族1，D 组（Nr1d）和RAR 相关孤独受体（ROR），编码核受体REV-ERB 和ROR[5]。REV-ERBs 抑制RORs 并 可以激活BMAL1 的转录[6]，产生BMAL1 mRNA 的节律性振荡。BMAL1在调控元件中的节律性结合：CLOCK/NPAS2 和REVERB/ROR 分别结合在E-box 和REV-ERB/ROR 序列上，在涉及许多不同功能的特定细胞或组织中，驱动大量基因有节奏地表达[7]。转录反馈回路的功能和时间依赖于翻译后调控转录因子稳定和降解的修饰过程[8]。这种分子水平的节律性振荡几乎存在于哺乳动物的所有细胞和组织中，基因的节律性表达最终产生与生理功能相关的节律性行为[9]。

3 生物钟与哺乳动物生理代谢

3.1 生物钟与松果体 在脊椎动物的进化过程中，松果体由最低级脊椎动物的感光器官[10]进化到低级脊椎动物的感光内分泌器官[11]，最终进化到哺乳动物的神经内分泌器官[12]。在下丘脑神经SCN 主生物钟的调控下，哺乳动物松果体合成并分泌褪黑素。褪黑素作为机体生物钟的重要调控因子，具有维持机体节律与环境周期同步的作用。下丘脑中SCN 含有大量的褪黑素受体。哺乳动物体内褪黑素的分泌一般在夜晚呈现上升趋势，并且在凌晨02:00—04:00 达到峰值。若SCN 受到外界环境的干预，抑制褪黑素的合成分泌，引发节律相关基因的失调，则会导致动物体内内源性褪黑素的分泌不足，进而引发机体各组织器官功能性衰退。这与免疫性疾病、神经退行性疾病以及繁殖障碍等发生有关。Weissová 等[13]研究表明，外源补充褪黑素可以改善由衰老引起的机体节律紊乱。

3.2 生物钟与代谢酶基因 细胞的增殖、分化、衰老、凋亡等是生命活动最基本的过程，在各个细胞周期的代谢过程中都呈现出精准、有序、高度协调的特征。生物钟相关基因通过调节编码代谢酶的节律性表达，从而调节细胞代谢。

BMAL1 直接靶向编码限速酶的基因，如作用于糖异生过程中的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）[14]。链脂肪酸延伸酶6（Elovl6）作用于脂肪酸合成以及甘油三酯水解酶介导的甘油三酯分解[14]。CLOCK 控制其他转录因子的节律性表达或节律性活动，从而给新陈代谢相关基因的表达施加了节律[15]。例如，受BMAL1:CLOCK 控制的转录因子DBP、TEF、HLF，通过对核构成雄甾烷受体的控制调异生物质代谢的节律[16]。REV-ERBa 通过直接与DNA 结合或与其他转录因子相互作用间接控制转录。抑制生物钟基因转录需要REV-ERBa 的DNA 结合域，而脂质代谢基因的转录需独立于DNA 结合域，并且涉及REV-ERBa 通过其他转录因子与DNA 的结合过程。此外，REV-ERBa 控制许多代谢因子的昼夜节律性转录。例如，REV-ERBa 影响Insig2 的昼夜转录。REV-ERBα指示组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）的基因组招募，以指导组蛋白乙酰化的昼夜节律和脂质代谢相关基因的表达[16]。Insig2 编码一种跨膜蛋白，将SREBP 蛋白隔离到内质网，从而控制胆固醇和脂质代谢[16]。PER2 直接与过氧化物酶增生物激活受体α（PPARα）有节律地相互作用，进而调节编码葡萄糖6 磷酸酶的靶基因G6pc[17]。PER2 同时通过阻断过氧化物酶增殖因子激活受体（PPARγ）靶向启动子的募集促进脂肪生成[18]。CRYs 通过与糖皮质激素竞争PEPCK1 启动子中的糖皮质激素反应元件来调节能量底物向葡萄糖的转化[19]。时间节律还与染色质修饰因子相互作用，实现表达的周期性激活和抑制。

3.3 生物钟与线粒体活动 生物钟通过调节线粒体分裂、线粒体自噬等线粒体活动以及生物发生来维持生物能量需求增加时的呼吸过程。烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）是一种催化NAD 合成中的限速酶。生物钟通过控制NAMPT 的节律来控制NAD 的补救合成途径[20]。NAD 生物合成中的生物钟节律驱动NAD+依赖组蛋白去乙酰酶（SIRTs）的震荡。因此，生物钟通过控制细胞能量状态的振荡来协调SIRT 驱动的细胞生理状态。线粒体SIRT3 的节律性活动可以引发线粒体氧化磷酸化的节律活动[21]。反之细胞的NAD+/NADH 氧化还原状态影响BMAL1:CLOCK 的转录活性[22]。SIRT1结合BMAL1:CLOCK基因的表达通过节律的方式促进CLOCK 蛋白质和组蛋白的脱乙酰作用，从而在氧化还原状态和生物钟之间建立一个反馈回路[23]。SIRT6 与BMAL1 的染色质招募相互作用：时间可以调节与节律相关的一系列基因，这些基因分别受到SIRT1基因的调控[24]。SIRT6 通过调控代谢转录因子的固醇反应原件结合蛋白（SREBP1）的染色质招募来调控脂肪酸的昼夜代谢[24]。

4 生物钟与繁殖

哺乳动物受孕及生产的成功由一系列关系紧密的生理活动共同协调完成。下丘脑-垂体-性腺轴（Hypothalamic-Pituitary-Gonadal Axis，HPGA）主要起到调控哺乳动物的繁殖功能的作用。卵巢中卵泡发育的晚期，血浆中雌二醇（E2）浓度上升，促黄体素（LH）浓度也到达峰值。在卵泡发育到达成熟排卵前期E2对GnRH 的分泌抑制解除，促使GnRH 从下丘脑POMA区域释放，促使垂体前叶中LH 的释放，最终促进卵母细胞从卵泡中排出。

褪黑素作为生物钟重要的调节因子，诱导机体的自然睡眠，克服睡眠障碍，提高睡眠质量，起到调节昼夜节律的作用；同时作为一种重要的生殖激素，也在动物性成熟、卵泡发育、排卵、黄体生成、妊娠和分娩等过程发挥着重要的作用。研究表明，卵巢局部褪黑素自分泌信号参与排卵的调控[25]。并且在早期胚胎发育过程中，褪黑素可以通过MT1 受体促进胚胎的发育[25]。此外，在胚胎附植过程中，褪黑素可以通过MT2 受体促进子宫接受态的形成[25]。研究表明，稳定变化的光周期通过褪黑素调控繁殖相关神经递质的变化，如Kisspeptin[26]。同时光周期又通过褪黑素介导调控GnRH 神经元的周期性变化，进而调控繁殖相关生理功能的发展和发生。

最新研究表明，哺乳动物的繁殖性能受到内源性生物钟的调控，即繁殖性能相关基因的表达呈现出节律性。下丘脑SCN 为哺乳动物的节律中枢，它与外界的光周期信号相互配合，通过褪黑素引发下丘脑繁殖相关基因的节律性表达[5]。昼夜节律的变化不仅通过调控繁殖基因的节律性表达影响动物的繁殖性能，还可以通过影响繁殖相关激素的分泌来调控动物的繁殖机能。昼夜节律可以影响大鼠、摩拉奶牛、蒙古绵羊等哺乳动物的性激素的分泌和性成熟[27]。Hacker 等[28]发现，延长光照可以促进后备母猪的性成熟，同时缩短初情期日龄。

在哺乳动物中，SCN 的损伤会导致发情周期的丧失。在大鼠发情前期的下午，使用巴比妥类药物阻断对其腹外侧和背内侧的SCN 通讯信号，会导致GnRH 的释放延迟24 h[29]。生物钟基因的突变或缺失会造成雌雄动物的繁殖障碍。生物钟基因CLOCK 突变的小鼠外周组织节律出现紊乱，发情周期也出现紊乱，同时施加持续性的黑暗条件会加剧这种节律性的紊乱[30]。PER1 和PER2 敲除鼠随着年龄的增长也出现发情周期紊乱的现象。生物钟基因BMAL1 突变的小鼠出现发情周期不规律和排卵障碍的现象，虽然有个别小鼠可以完成排卵过程，但是不能形成正常的黄体[30]。

5 生物钟与肠道菌群

肠道是微生物在动物体内定植的主要位置，其中在人体肠道中定植的菌群数量就高达1 014 个，可以构成108 种属，总重量可以达到约1.5 kg，这些数量庞大、组成复杂的微生物共同组成肠道群。

近年来，越来越多的研究证明肠道菌群与宿主健康存在必然的联系。肠道菌群利用宿主动物代谢产物得以存活；同时，动物机体可以吸收菌群代谢产生的营养物质。肠道菌群可以直接或间接参与三大营养物质的代谢，例如参与微生物合成，影响脂肪的吸收、合成和分布等[31]。单胃动物盲肠菌群可以产生有机酸，提高蛋白质和能量的利用率[32]。肠道菌群通过作用于宿主免疫系统增强癌症等免疫性疾病的治疗效果[33]。反之，肠道菌群结构的失调会直接导致疾病的发生。肠道菌群紊乱会产生许多趋化因子和炎症因子，它们会通过各种途径进入中枢神经系统，影响中枢神经元的功能[34]，如抑郁症、焦虑症、自闭症、阿尔茨海默病、帕金森等神经性疾病都证实与肠道菌群结构的紊乱有关[35]。研究证实肥胖表型与肠道菌群紊乱具有直接关联性。肠道菌群中厚壁菌门与拟杆菌门的丰度比例则与宿主的肥胖或糖尿病等有着密切的联系[36]。研究发现，肥胖小鼠体内厚壁菌门的丰度有所增加，拟杆菌门的丰度则降低，并且肠道菌群的多样性较正常对照组的小鼠也呈现降低的趋势[36]。肠道菌群可以分解人体无法消化的植物性多糖，生成短链脂肪酸，参与到宿主的能量代谢过程中[37]。与此同时，肠道菌群之间也存在互作，例如，埃希氏杆菌属（Escherichia）提供90%以上的蛋白FimA（COG3539）和PapC（COG3188）来参与菌毛的装配，与其他菌属形成合作共生[38]。

尽管人们一定程度上对昼夜节律失调导致繁殖障碍的机制尚不清楚，但肠道菌群的变化是对繁殖生理变化的一种反应。例如，妊娠糖尿病（GDM）的患病率居高不下且呈现逐年增加的趋势，严重影响产妇和新生儿的健康，这是一种与繁殖和代谢等密切相关的疾病。研究证实，肠道菌群在妊娠糖尿病的发展过程中有着不同程度的影响[39]。与肠道微生物相关的多项研究表明，相对丰度大约为15% 的细菌存在节律性振荡现象，这占据了肠道菌群种类的60%[40]。此外，研究还发现，不同妊娠时期的肠道菌群有着显著的变化，这可能与妊娠期的代谢功能变化和免疫系统的反应有着直接的联系[41]。妊娠后期较妊娠前期Proteobacteria和Actinbacteria的丰度显著升高，并且伴随着能量损失和炎症反应的发生[41]。肠道微生物中至少有一种，即产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes），在与人体肠道分离培养后，还可以继续表现昼夜节律[40]。作为重要的生物钟调节因子和生殖激素——褪黑素可以改变肠道微生物的组成，例如，降低厚壁菌门与拟杆菌门的比例。褪黑素通过宿主肠道微生物影响肠毒素大肠杆菌在宿主肠道中的定植。同时褪黑素还通过作用于肠道微生物直接影响宿主体重的增加以及胃肠道的形态结构[42]。反之，肠道微生物自身可产生短链脂肪酸（如乙酸、丙酸、丁酸等），以及儿茶酚胺类、五羟色胺、褪黑素等信号因子调节宿主肠道内分泌，作用于神经系统和免疫系统，与宿主形成互作[43]。

6 展 望

繁殖机能的变化伴随着肠道菌群稳态的变化。人们需针对昼夜节律失调与代谢综合征之间的相互作用机理做更深一步的研究。进而把调控机体生物钟作为一种疾病治疗方式，这样具有“增强节律”作用的有机化合物，或许可以成为研究哺乳动物繁殖障碍性疾病、糖尿病和肥胖等代谢性疾病、菌群失调导致的免疫性疾病、衰老相关的退行性疾病的新工具。