华山松籽油亚油酸的富集纯化及降血脂活性研究

郭剑霞，张谨华，潘玉峰，温 学

(晋中学院 生物科学与技术学院， 山西 晋中 030619)

随着人们生活水平的提高，高血压、高脂血症等营养性疾病的发生率呈上升趋势，成为威胁人类生命健康的主要疾病。目前，临床上常采用药物治疗和饮食干预的方法控制和降低血脂水平。但是药物治疗费用相对较高，且存在不同程度的副作用。饮食控制虽然能够在一定程度上起到调节机体内脂质代谢的作用，但往往长期控制效果欠佳。相比之下，食用降血脂功能性食品可能是长期控制血脂更理想的方法，开发纯天然的功能性降血脂食品是目前的研究热点[1-2]。

华山松籽仁为松科植物华山松(Pinusarmandifranch)的果仁，系我国特产，华山松籽含油量高达50%～60%，其油中亚油酸含量最高，达57.7%。亚油酸作为重要的功能性多不饱和脂肪酸，具有重要的生理作用和药用价值[3-5]。亚油酸有助于降低人体内血清胆固醇含量，使机体高密度脂蛋白胆固醇升高，减少脂质在血管壁上的沉积，防止动脉血栓的形成，使血管壁功能得到提高和完善[6-7]。我国华山松籽资源丰富,而目前关于华山松籽油的研究报道较少。从华山松籽油中富集纯化亚油酸，开展对华山松籽油功能成分的开发与研究对生产具有保健功能的油脂具有重要意义。

目前，对亚油酸的富集纯化方法主要有尿素包合法[8]、低温结晶法[9]、分子蒸馏法[10]和超临界CO2萃取法等[11-13]。其中，尿素包合法主要依据长链脂肪酸的不饱和度进行分离，尿素本身具有充实的四方晶系，当其在有机溶剂中遇到脂肪族化合物时，尿素分子间会通过强大的氢键力以右旋方式在有机物分子的周围沿棱柱边螺旋上升，形成宽大的六方晶体。直链饱和脂肪酸因其分子能自由旋转，位置取向较多，故最易与尿素形成稳定包合物，而不饱和脂肪酸中的双键限制分子旋转，造成空间位阻大，不易被包合，从而可得到较高纯度的多不饱和脂肪酸。尿素包合法分离效果好,设备简单、操作方便,适合工业化生产[14-15]。

本研究通过单因素试验初步优化了尿素包合法富集纯化亚油酸的工艺，同时以昆明小鼠为研究对象，考察华山松籽油中亚油酸对高脂小鼠的血脂调节作用，以期为华山松籽油在高脂血症患者的饮食辅助治疗提供重要的参考价值，对控制高脂血症的发病率及促进华山松籽的深度开发有着重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

华山松籽油，由吉林省派诺生物技术有限公司的华山松籽仁经超临界CO2萃取制得；清洁级健康昆明种小鼠(雄性，体重 18～22 g)，山西医科大学实验动物中心提供；基础饲料，山西医科大学实验动物中心提供；高脂饲料(配方为86.5%基础饲料，5.8%蛋黄粉，0.5%胆固醇，7%猪油，0.20%牛胆酸钠)；尿素、无水硫酸钠、95%乙醇、石油醚、甲醇、硫酸、盐酸、氢氧化钾等，均为分析纯；正己烷，色谱纯；混合脂肪酸甲酯标准品(纯度>99.5%)，购于美国Sigma公司；甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)等测定试剂盒，购于南京建成生物工程研究所。

RE-5203A型旋转蒸发器，PHS-3C型酸度计，日本岛津GC2010气相色谱仪。

1.2 试验方法

1.2.1 混合脂肪酸的制备

参考文献[16]中的方法。称取50 g华山松籽油于烧瓶中，加入300 mL 4%的氢氧化钾-95%乙醇溶液，用磁力搅拌器缓慢搅拌升温至75℃，皂化回流2.0 h 至皂化完全。加入适量的温水，继续搅拌 0.5 h，使形成的皂化物充分溶解。用 20%的盐酸调节 pH 约为 2，继续搅拌 15 min。倒入分液漏斗中，静置分层，去掉下层的水层。加入适量石油醚(沸程30～60℃)萃取，用温水洗涤至中性，加入无水硫酸钠脱水，抽滤，滤液经旋蒸除去石油醚，得到混合脂肪酸。

1.2.2 尿素包合法纯化亚油酸

参考文献[16]中的方法。将95%乙醇与尿素按照一定比例加入烧瓶中，水浴加热，搅拌，待尿素完全溶解后，按照与尿素一定的比例加入混合脂肪酸，回流 40 min。将溶液倒入锥形瓶中，冷却至室温后转入低温包合一定时间。减压抽滤，滤液旋蒸除去乙醇，温水洗涤，用 20%的盐酸调节 pH 约为2，转移至分液漏斗中，加入石油醚(沸程30～60℃)萃取，用温水洗至 pH 为 7 后，加入无水硫酸钠脱水，抽滤，旋转蒸发除去石油醚，即得产品亚油酸。亚油酸得率=产品亚油酸质量/混合脂肪酸质量×100%。

1.2.3 亚油酸含量的测定

1.2.3.1 脂肪酸甲酯的制备

取样品0.1 g于烧瓶中，加入2 mL 1%硫酸-甲醇溶液，于75℃的水浴中反应1 h。反应结束后分别加入2 mL生理盐水和2 mL正己烷，振荡，静置分层后取上层正己烷相，加入无水硫酸钠离心(4 000 r/min，20 min)，吸取上清液置于棕色瓶中-20℃保存，待气相色谱分析。

1.2.3.2 脂肪酸含量测定

采用气相色谱仪测定亚油酸含量，面积归一化法定量。气相色谱条件：CBP-20毛细管色谱柱(50 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升温为初始温度180℃，以6℃/min的速度升至240℃，保持40 min；进样口温度和检测器温度均为280℃；FID检测器；载气为高纯氮气，流速30 mL/min；氢气流速47 mL/min；空气流速400 mL/min；进样量1 μL。

1.2.4 华山松籽油纯化亚油酸(PAFL)降血脂试验

1.2.4.1 高脂模型建立及动物分组和饲喂安排

选取健康雄性昆明小鼠 50 只，小鼠自由饮水，基础饲料饲喂1周后，按体重和总胆固醇含量(TC)平均分配原则将小鼠分成正常对照组、高脂模型组、PAFL低剂量组、PAFL中剂量组、PAFL高剂量组，每组 10 只。正常对照组小鼠饲喂基础饲料，其他组小鼠饲喂高脂饲料，PAFL低、中、高剂量组分别灌胃PAFL 1.7、3.5、5 mL/(kg·d)。各试验组小鼠每天每只灌胃 0.4 mL 生理盐水，自由饮水，自然光照，饲喂28 d。饲喂期间，每天保持充足的食物和饮水，期间每天记录小鼠的体重和摄食量。在饲喂14 d后，从正常对照组和高脂模型组(用高脂饲料诱导而不加用受试物的小鼠) 中随机选 6 只小鼠，经眼球取血，分离血清，根据试剂盒的说明方法测定其TC、TG和HDL-C 以判断模型是否建立成功。经测定小鼠血清TC、TG水平明显升高，HDL-C水平明显降低，表明小鼠高脂模型构建成功。

1.2.4.2 小鼠血脂指标测定及动脉硬化指数计算

小鼠饲喂 28 d 禁食 12 h，眼眶静脉丛采血，4℃冰箱静置 3 h，离心(3 000 r/min，15 min，4℃)，取血清，试剂盒测定小鼠血清中的 TC、TG、LDL-C和HDL-C水平。同时计算动脉硬化指数(AI)(动脉硬化指数=(TC含量-HDL-C含量)/HDL-C含量)。

1.2.4.3 小鼠肝脏重及肝脏指数的测定

小鼠连续灌胃28 d，在末次灌胃 24 h 后，称量体重，立即摘取肝脏，生理盐水冲洗，滤纸吸干后称重，计算肝脏指数(肝脏指数=肝脏质量/小鼠最终体质量)。

1.2.5 数据处理

试验数据均采用Microsoft Excel 进行整理，结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 尿素包合法分离纯化亚油酸条件优化

2.1.1 包合时间对纯化的影响

在包合温度-5℃、混合脂肪酸与尿素质量比值 0.3、95%乙醇与尿素体积质量比值4的条件下，考察包合时间对亚油酸纯度和得率的影响，结果见图 1。

图1 包合时间对亚油酸纯度和得率的影响

由图 1 可知，包合时间在 6～24 h 范围内，随着包合时间的延长，亚油酸纯度和得率逐渐增加，当包合时间为 24 h时，结晶过程基本完成，亚油酸纯度与得率最佳。再延长包合时间，亚油酸得率略有下降。这可能是由于包合时间较短时，软脂酸、油酸等饱和脂肪酸及单不饱和脂肪酸并未与尿素充分形成包合物或是包合还未达到饱和，故延长包合时间反应向正向进行，生成物增加，亚油酸纯度提高，继续延长包合时间，少量的尿素以晶体形式析出，而尿素包合过程中存在包合和解包合的动态平衡，尿素晶体的析出使得反应向解包合的方向进行，尿素晶体数量和体积增加，在抽滤的过程中，会携带少量的亚油酸，导致亚油酸的得率反而下降。综合考虑，选择包合时间为 24 h。

2.1.2 包合温度对纯化的影响

在混合脂肪酸与尿素质量比值0.3、包合时间24 h、95%乙醇与尿素体积质量比值4的条件下，考察包合温度对亚油酸纯度和得率的影响，结果见图 2。

图2 包合温度对亚油酸纯度和得率的影响

由图 2可见，随着包合温度升高，亚油酸得率逐渐增加，但纯度降低。这是因为尿素包合为放热反应，低温有利于包合反应的进行并有助于形成稳定的包合物。在形成尿素包合物时体系放热，反应随温度降低朝正向进行，进而快速形成包合物晶体便于分离，而当温度过低时，虽然滤液中亚油酸纯度得到提高，但影响亚油酸得率。综合考虑，当包合温度为-10℃时，亚油酸纯度和得率均较为理想，为最适包合温度。

2.1.3 混合脂肪酸与尿素的质量比值对纯化的影响

在包合温度-10℃、包合时间24 h、95%乙醇与尿素体积质量比值4条件下，考察混合脂肪酸与尿素质量比值对亚油酸纯度和得率的影响，结果见图3。

图3 混合脂肪酸与尿素质量比值对亚油酸纯度和得率的影响

由图3可见，随着混合脂肪酸与尿素质量比值的增加，亚油酸的纯度下降，得率上升。当混合脂肪酸与尿素质量比值小于0.4时，随着混合脂肪酸与尿素质量比值的增加，亚油酸得率上升，当混合脂肪酸与尿素质量比值大于0.4时，亚油酸得率基本保持不变。这是因为尿素分子在结晶过程中能够与饱和脂肪酸或单不饱和脂肪酸形成较稳定的晶体包合物析出，而多不饱和脂肪酸由于双键较多，碳链弯曲，具有一定的空间构型，不易被尿素包合。当尿素用量过多时，一部分亚油酸随尿素形成的包合物析出，得率降低；而当尿素用量过少时，饱和脂肪酸或单不饱和脂肪酸未能被全部包合，有一部分还在有机相中，导致亚油酸的分离效果不佳，纯度偏低。综合上述因素，混合脂肪酸与尿素质量比值0.4为尿素包合时最佳比例。

2.1.4 95%乙醇与尿素的体积质量比值对纯化的影响

在包合温度-10℃、包合时间24 h、混合脂肪酸与尿素质量比值0.4的条件下，考察95%乙醇与尿素体积质量比值对亚油酸纯度和得率的影响，结果见图4。

图4 95%乙醇与尿素体积质量比值对亚油酸纯度和得率的影响

溶剂在包合过程中主要起到溶解尿素的作用，甲醇有毒，考虑到毒性、溶解度等因素，经预试验选用95%乙醇作为溶剂。当尿素完全溶于溶剂中并达到饱和状态时，为包合效果最佳。由图4可见，95%乙醇与尿素体积质量比值较小时，亚油酸纯度和得率也较低。这是因为当95%乙醇与尿素体积质量比值过小时，乙醇用量较少，尿素无法充分溶解，溶液较黏稠，分子运动阻力增大，包合反应不充分，使亚油酸纯度较低，且亚油酸在尿素晶体表面黏附，导致亚油酸的得率偏低。随着95%乙醇与尿素体积质量比值的增加，亚油酸的纯度和得率均缓慢升高。这可能是因为随着溶剂增多，脂肪酸溶解度也在逐渐增大，从而产品得率得以提高，且使尿素对饱和脂肪酸以及单不饱和脂肪酸结合能力变强，亚油酸纯度得到了提高。当95%乙醇与尿素体积质量比值过大时，使尿素包合逆反应加速，对饱和、单不饱和脂肪酸的包合程度下降，导致亚油酸纯度降低。综合考虑，95%乙醇与尿素体积质量比值为5时，亚油酸纯度及得率均较为理想，为95%乙醇与尿素的最佳体积质量比值。

2.2 尿素包合法富集纯化的华山松籽油亚油酸纯度

由单因素试验确定尿素包合法分离纯化亚油酸最佳工艺条件为: 混合脂肪酸与尿素质量比值0.4，95%乙醇与尿素体积质量比值 5，包合时间 24 h，包合温度-10℃。在最佳工艺条件下进行3次平行验证试验，得到产品亚油酸的平均纯度为80.57%。亚油酸含量由原来的57.66%增加到80.57%，说明尿素包合法有效地富集了华山松籽油中的亚油酸。

2.3 华山松籽油中亚油酸功能评价

2.3.1 对小鼠体重的影响(见图5)

图5 PAFL对小鼠体重的影响

在整个饲喂期间，试验组小鼠毛色光洁，食欲正常，均未出现异常体征，未发生自然死亡。由图5可见，与模型组相比，华山松籽油纯化亚油酸(PAFL)并没有改变小鼠体重的变化趋势，在给小鼠连续灌胃 28 d 不同剂量的华山松籽油纯化亚油酸(PAFL)之后，小鼠体重虽高于正常对照组，但低于高脂模型组，且小鼠体重随灌胃剂量的增加而明显降低。说明PAFL有降低高脂小鼠体重的作用。

2.3.2 对小鼠肝脏重及肝脏指数的影响(见图6)

图6 PAFL对小鼠肝脏重与肝脏指数的影响

长期食用高脂饲料可导致受试动物肝脏脂质积累及病变，这可通过肝脏指数来反映。由图6可见，在给小鼠连续灌胃 28 d 不同剂量华山松籽油纯化亚油酸(PAFL)之后，小鼠肝脏重与肝脏指数虽然高于正常对照组，但低于高脂模型组。灌胃一定剂量的PAFL可以起到延缓高脂血症小鼠的肝脏重与肝脏指数增高的作用，并且肝脏重与肝脏指数随着灌胃剂量的增加而明显降低。肝肿大的特征是肝细胞过氧化体显著增加，降脂药长期致癌性的一项指标就是过氧化体的增生。目前许多降脂药物在服用后会明显地使肝脏增重、肿大[17]。本试验3个剂量组小鼠的肝脏指数均比高脂模型组小，不至于使肝脏肿大。因此，相比之下，华山松籽油纯化后亚油酸显得更为安全，也更具优越性。

2.3.3 对小鼠血脂水平的影响

2.3.3.1 对小鼠血清中 TG 及 TC 水平的影响(见图7)

图7 PAFL对小鼠TG与TC水平的影响

在小鼠的生长发育过程中，不同的膳食脂肪构成对机体脂质代谢有不同的影响。正常量的胆固醇对维持细胞功能、重要激素的合成等起重要作用。但当外源性胆固醇摄入过多时，易在血管壁上沉积，形成斑块使血管管腔狭窄，心脑组织长期缺氧便可引发心脑血管疾病；甘油三酯主要存在于乳糜微粒和极低密度脂蛋白中，极低密度脂蛋白及乳糜微粒对血管内皮细胞具有细胞毒性作用，能够促进泡沫细胞的形成和诱发炎症反应，使甘油三酯沉积在血管壁中，引发心脑血管疾病[18]。因此，控制血清胆固醇及甘油三酯含量在正常范围具有重要的意义。

由图7可见，高脂模型组相比于正常对照组，小鼠血清TC、TG 水平均有明显升高。给受试物组小鼠连续灌胃 28 d 不同剂量的华山松籽油纯化亚油酸(PAFL)，小鼠血清 TC、TG 水平明显低于高脂模型组，且小鼠血清 TC、TG 水平随灌胃剂量的增加呈下降趋势。说明给予高脂血症小鼠灌胃一定量的华山松籽油纯化亚油酸(PAFL)会明显降低其体内血脂水平。

2.3.3.2 对小鼠血清中 HDL-C 和 LDL-C 水平的影响(见图8)

图8 PAFL对HDL-C与LDL-C水平的影响

低密度脂蛋白(LDL)被称为是动脉硬化因子，其作用是将肝脏内合成的胆固醇运送到肝脏外围细胞。高密度脂蛋白(HDL)可介导胆固醇的逆转运，将血液中多余的胆固醇从周围组织转运至肝脏进行再循环，减少脂质在血管壁的沉积。HDL 被认为是动脉粥样硬化的保护因子。

由图8可见，与正常对照组相比，高脂模型组小鼠 HDL-C、LDL-C 水平发生了明显的变化，受试物组随华山松籽油纯化亚油酸(PAFL)灌胃剂量的增加，HDL-C 呈直线上升趋势，LDL-C 呈直线下降趋势。说明一定剂量的华山松籽油纯化亚油酸(PAFL)可以升高高脂血症小鼠血清中的高密度脂蛋白胆固醇水平，降低低密度脂蛋白胆固醇水平，保护血管功能。

2.3.3.3 对动脉硬化指数的影响(见图9)

图9 不同剂量PAFL对AI的影响

由图9可见，高脂模型组小鼠的动脉硬化指数(AI) 明显高于正常对照组，说明高脂模型组小鼠患高脂血症概率增加。与高脂模型组相比，受试物组小鼠的AI明显下降，说明华山松籽油纯化亚油酸(PAFL)有降低小鼠患高脂血症的作用，且随灌胃剂量的增加小鼠的AI下降明显。说明华山松籽油纯化亚油酸(PAFL)可明显改善小鼠血脂代谢水平，可降低机体动脉粥样硬化的患病风险。

3 结 论

本研究以华山松籽油为原料，以纯化后亚油酸的纯度和得率为指标，通过单因素试验初步确定尿素包合法分离纯化华山松籽油中亚油酸的最佳工艺条件为：混合脂肪酸与尿素质量比值0.4，95%乙醇与尿素体积质量比值5，包合温度-10℃，包合时间24 h。在最佳条件下，亚油酸的纯度为80.57%。对受试物小鼠连续灌胃28 d不同剂量的华山松籽油纯化亚油酸(PAFL)，研究其对小鼠体重、肝脏重与肝脏指数、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和动脉硬化指数(AI)的影响。结果表明，与高脂模型组小鼠相比，华山松籽油纯化后亚油酸(PAFL)可以明显降低高脂小鼠体重、肝脏重及肝脏指数，降低高脂小鼠血清TC、TG水平，具有提高血清HDL-C水平、降低LDL-C水平及AI的能力。说明华山松籽油纯化亚油酸(PAFL)可改善高血脂小鼠的高脂血症，华山松籽油纯化亚油酸(PAFL)可明显改善小鼠血脂代谢水平，可有效抑制动脉粥样硬化的形成和发展。