免疫荧光抗体法检测水中贾第鞭毛虫和隐孢子虫

莫婉湫， 赖竞峰， 刘晓颖

(东莞市东江检测有限公司，广东 东莞 523000)

贾第鞭毛虫和隐孢子虫(简称“两虫”)是寄生于人和动物体内的致病性原生动物［1］。“两虫”的潜伏期长、个体小、致病率高，而且对氯消毒剂具有较强的抗性［2］，影响供水安全［3］。《生活饮用水卫生标准》(GB 5749—2006)规定了饮用水中“两虫”的限值为＜1个/10L。

目前“两虫”的检测方法主要有免疫荧光法［4－6］、ICR 法、PCR 法［7－8］等。其中 ICR 法应用最早，但检测准确性较低［1－2］;PCR法由于需要进行基因检测，暂未得到广泛应用;免疫荧光法是目前国内外使用最广泛、发展最迅速的方法。笔者分别用Envirochek方法和Filta－Max Xpress快速方法过滤浓缩水样，将离心收集到的贾第鞭毛虫和隐孢子虫进行免疫磁分离和荧光抗体染色，同时通过测试和优化各试验步骤，探讨了检测过程中的影响因素，以期提高水中“两虫”的回收率。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

实验仪器:IDEXX Pressure Elution型快速淘洗装置、FM－3800型台式离心机、Pall带臂水平振荡器、DD－5M型离心机、DJ－1型磁力搅拌器，Barnant Masterflex L/S Easy－Load II型蠕动泵、Dynal样品混合器、VWR涡旋混合器、免疫磁混旋器、Olympus BX 51型荧光显微镜、Dynal L10侧平面试管、IEDXX快速滤芯、Pall褶聚醚砜滤纸滤囊。

实验试剂:免疫荧光染色试剂EsayStain、质控标样ColorSeed、免疫磁分离试剂盒、固封剂、淘洗缓冲液，实验用水为纯水。

1.2 水样的采集

按照《生活饮用水标准检验方法》(GB/T 5750—2006)进行水样的采集、保存和运输。

1.3 实验方法

1.3.1 富集浓缩

① Envirochek方法

在磁力搅拌器上边搅拌边过滤水样，流速为2 L/min，打开排气阀排气，待滤囊内注满水后关闭排气阀。过滤完毕用纯水冲洗采样容器，一并过滤。每个滤囊中加入110 mL淘洗液后插到带臂水平振荡器上，控制排气口在12点方向，以900 r/min振荡10 min，将滤囊中的淘洗液全部倒入250 mL锥形离心瓶。再加入110 mL淘洗液到滤囊中，将排气口设置在4点和8点方向，各振荡5 min，然后将滤囊中的淘洗液全部倒入250 mL锥形离心瓶中。将离心瓶置于离心机中，1500 g离心15 min，自然减速以避免扰乱沉淀物。

② Filta－Max Xpress快速方法

在磁力搅拌器上边搅拌边过滤水样，流速为4 L/min。过滤完毕用纯水冲洗采样容器，一并过滤。用Pressure Elution型快速淘洗装置进行淘洗，用500 mL锥形离心瓶收集淘洗液。将离心瓶置于离心机中，2 000 g离心15 min，自然减速以避免扰乱沉淀物。

两种富集浓缩方法都要在不扰乱沉淀物的情况下吸走上清液，根据压实沉淀物体积计算出需保留的体积。若沉淀物体积≤0．5mL，保留10 mL液体;当沉淀物体积大于0．5 mL时，则保留体积为沉淀物体积的20倍。

1.3.2 免疫磁分离

定量转移10 mL水样浓缩物到侧平面试管中，加入1 mL buffer A试剂和1 mL buffer B试剂，再加入贾第鞭毛虫和隐孢子虫磁珠各100μL。将侧平面试管置于免疫磁混旋器上，混合1 h。在磁珠捕获“两虫”后，用免疫磁浓缩器的磁极将其与水中其他杂质分离。加入0．1 mol/L盐酸50μL使磁珠上的“两虫”解离，转移解离液至玻片内。重复操作1次，收集二次酸化的解离液于另一玻片内，每个玻片预先滴加5μL 1 mol/L氢氧化钠。

1.3.3 荧光抗体染色

4.信息技术和制造技术相互融合。20世纪80年代中后期，日本的信息技术和生产技术已相互融合，大量信息技术开始应用于工业生产过程中，丰田生产模式(多品种、小批量、局部柔性化制造的流水线生产)开始流行。计算机在制造工艺和生产过程中广泛应用，各种计算机辅助软件，如计算机辅助制造(CAM)、计算机辅助工艺过程设计(CAPP)、计算机辅助测试(CAT)[8]等进一步提升了制造过程的智能化程度，为开展智能制造打下良好基础。各类先进生产技术的雏形开始出现并投入生产，如加工中心(MC)机械、自动主体仓库、机器人、柔性制造系统(FMS)等，进一步实现了制造产品种类的多样化和生产过程的柔性化。

将玻片于37℃培养箱干燥(干燥时间最长为1 h)，加入50μL甲醛，干燥。

荧光染色:加入50μL Easystain到玻片中，湿盒在37℃下避光培养30 min以上，吸掉液体，加入100μL PBS并静置2 min，吸除多余的PBS。

DAPI染色:加入50μL DAPI染色液到玻片中，室温静置2 min后吸掉过量的液体，加入50μL纯水，静置1 min后吸掉多余的纯水。加1滴固封剂后加盖玻片，避免气泡。

1.3.4 镜检

用荧光显微镜对玻片进行全井扫描并计数。贾第鞭毛虫和隐孢子虫都会发出明亮的苹果绿荧光，其中贾第鞭毛虫为椭圆形(长8～14μm、宽7～10 μm)，隐孢子虫为略微椭圆的圆形(直径为2～6 μm)。在紫外光下，DAPI阳性会出现4个亮蓝色的核。

1.4 水样加标回收试验

分别用Envirochek方法和Filta－Max Xpress快速方法对纯水、出厂水和水源水进行加标回收试验。每个水样的体积为20 L，各加入1支质控标样ColorSeed，镜检计数并计算回收率。

1.5 免疫磁分离+染色镜检阶段的加标回收试验

将1支质控标样ColorSeed加入侧平面试管内，用10 mL纯水代替水样浓缩物，镜检计数并计算免疫磁分离+染色镜检阶段的回收率、富集浓缩阶段的回收率。

2 结果与讨论

2.1 水样加标回收试验结果

表1 Envirochek方法和Filta－Max Xpress快速方法对“两虫”的回收率

从表1可见，两种方法的加标回收率均达到国标要求(10% ～100%)。此外，无论是纯水、出厂水还是水源水，Filta－Max Xpress快速方法的回收率均高于Envirochek方法。两者对水源水的加标回收率相差最大，这可能是因为富集浓缩的原理不同:Envirochek方法通过褶聚醚砜滤纸滤囊和带臂水平振荡器，利用振荡把“两虫”淘洗出来;而Filta－Max Xpress快速方法通过快速滤芯和自动淘洗装置，后者利用高压实现对滤芯的反向冲洗，淘洗更充分。

两种方法的二次酸化操作均可回收到“两虫”，因此对磁珠进行二次酸化可提高“两虫”的加标回收率。

2.2 二次淘洗对回收率的影响

对水源水加标样品淘洗后的滤囊和滤芯进行二次淘洗，再进行免疫磁分离、荧光抗体染色、镜检。采用Envirochek方法的滤囊二次淘洗后，可使贾第鞭毛虫和隐孢子虫回收率分别提高8%和10%;Filta－Max Xpress快速方法的滤芯采用二次淘洗后，可使贾第鞭毛虫和隐孢子虫回收率分别提高5%和4%。因此，对滤囊或者滤芯进行二次淘洗，均可提高“两虫”的加标回收率，其中对Envirochek方法回收率的提高效果更明显。

2.3 免疫磁分离+染色镜检阶段的回收试验

从表2可见，“两虫”在富集浓缩阶段的回收率低于免疫磁分离+染色镜检阶段的回收率，说明“两虫”在富集浓缩阶段最难回收。富集浓缩阶段包括滤水、淘洗、浓缩多个步骤，滤水步骤可能会发生“两虫”的穿透，淘洗步骤可能存在淘洗不完全的情况，浓缩步骤容易搅动沉淀物，这都会影响“两虫”的回收率。因此富集浓缩阶段是控制回收率较为关键的一步。

表2 不同阶段“两虫”的加标回收率

2.4 注意事项

2.4.1 过滤阶段

控制Envirochek方法的滤速不超过2 L/min，Filta－Max Xpress快速方法的滤速不超过4 L/min。水样(特别是加标水样)要在磁力搅拌器上边搅拌边过滤;滤器在过滤过程中尽量保持垂直，以有利于“两虫”的截留。

2.4.2 淘洗阶段

PBST缓冲液现配现用，控制缓冲液pH值在7．4以下，偏碱性时不易洗出“两虫”;在缓冲液中加入Tween20，有利于减少原虫挂壁;对滤囊/滤芯进行二次淘洗可提高“两虫”回收率。

2.4.3 浓缩阶段

离心瓶与适配器一起用十分之一天平配平，保证误差在0．5 g以内，尽量减少离心过程的摆动;离心机结束工作后，使样品自然减速以免扰乱沉淀物，影响浓缩结果;用虹吸法或移液枪吸走上清液时，虹吸管口/枪头口要在离心杯中心靠近液面处吸取上清液，以减少沉淀的损失。一般保留10 mL液体，如果沉淀物体积大于0．5 mL，要注意计算需保留液体的体积，然后取10 mL浓缩液进行下一步试验，防止沉淀物过多对“两虫”回收率的影响。

2.4.4 捕获阶段

侧平面试管在旋摇时不能装太满，以留出空间让磁珠在旋摇过程中与“两虫”充分靠近，提高捕获率。

2.4.5 免疫磁分离阶段

用Buffer A试液清洗侧平壁试管时，注意只清洗有磁珠的平面，不能将液体晃到其他平面，以防磁珠粘附影响回收。酸化步骤得到的盐酸洗脱液，最好一次性转移至载玻片中，以避免多次转移带来损耗;转移盐酸洗脱液时，不能从磁极上取下磁板，转移过程中不碰贴壁的磁珠;盐酸洗脱液移入载玻片后要轻轻吸混盐酸和氢氧化钠，使中和完全;过酸或者过碱都会影响“两虫”的染色，因此盐酸和氢氧化钠的浓度要精确，最好现配现用，以保证在载玻片上的液体最后达到酸碱平衡。

2.4.6 染色阶段

载玻片上的样品干燥可在培养箱中进行，但注意培养箱温度最好不要超过37℃，干燥时间不超过1 h;Easystain染色如果用到培养箱，需先把湿盒置于培养箱中预热15 min;Fixing Buffer洗脱液需要保持冰冷，从冰箱取出后2 min之内使用，每次即用即取;Fixing Buffer洗脱液要逐滴缓慢加入，避免溢出中心圆圈。

2.4.7 时间的控制

样品采集后72 h内完成过滤，过滤后的滤芯/滤囊应置于0～4℃避光保存;淘洗和制片在24 h内完成，从玻片干燥到染色在72 h完成，镜检在7 d内完成。

3 结论

由于“两虫”会对人体健康产生威胁，为了对其进行有效的防范，必须做好水中的检测工作。与Envirochek方法相比，Filta－Max Xpress快速方法对“两虫”具有更高的加标回收率。对滤囊或者滤芯进行二次淘洗，在过滤、淘洗、浓缩、捕获、免疫磁分离、染色阶段规范方法和步骤，并控制好操作时间，均有助于提高“两虫”的回收率。