帕立骨化醇残留清洁分析方法的验证及应用

张 振，汪广厚

（1. 北京世桥生物制药有限公司，北京 101301； 2. 首都医科大学，北京 100069）

帕立骨化醇（19-去甲-1，25-二羟维生素D2）是一种选择性维生素D 受体激动剂（VDRA），可激发维生素D 反应通路产生生物学效应。该药主要用于治疗接受血液透析的慢性肾功能衰竭患者的继发性甲状旁腺功能亢进[1]。因帕立骨化醇注射液在本公司生产车间存在其他共线产品，为避免交叉污染，需对帕立骨化醇残留物进行检测。本研究中参考药品生产质量管理规范（GMP）指南确定帕立骨化醇注射液在制药设备上的最大允许残留限度为0.13 ng/cm2[2]，参考药典要求[3]，以此限度采用反相液相色谱法[4]和外标定量的方式，建立帕立骨化醇注射液残留清洁分析方法，并对该方法进行验证[5-7]，以确保此方法能有效地检测清洁帕立骨化醇注射液的生产设备表面残留物，以防止帕立骨化醇对后续产品造成交叉污染[8]。现报道如下。

1 仪器、试药与材料

1.1 仪器

1260 型高效液相色谱仪（美国Aglient 公司）；XPE205 型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；3-5N 型离心机（湖南恒诺仪器设备有限公司）；XH-C型旋涡混合器（新宝仪器厂）；KH500DE 型超声波清洗机（昆山禾创超声仪器有限公司）。

1.2 试药与材料

帕立骨化醇乙醇溶液对照品（USP 对照品，批号为R016S0，含量为508 μg/mL）；聚酯纤维棉签（深圳市华晨阳科技有限公司，批号为CY715A）；乙腈、乙醇均为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil100-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：15%乙腈（A）-乙腈（B），梯度洗脱（见表1）；检测波长：252 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：100 μL；柱温：25 ℃；样品室温度：5 ℃；稀释剂、擦拭溶剂：50%乙醇；擦拭材料：不锈钢板10 cm×10 cm，有机玻璃板，钢化玻璃板和聚四氟乙烯板。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.2 溶液制备

空白棉签液：预处理中，将100 根棉签置500 mL 烧杯中，加约250 mL 甲醇，超声（功率250 W，频率40 kHz，下同）处理20 min，倒掉甲醇，用250 mL 新鲜甲醇重复该步骤2 次，再用250 mL 水重复该步骤1 次，最后用250 mL 新鲜乙醇重复该步骤2 次。将棉签置60 ℃烘箱中烘干或自然风干。将包裹在2 根预处理过的干净棉签顶端的棉布剪下，放入离心管中，用1 mL 擦试剂和1 mL稀释剂浸湿，加塞后超声15 min，涡旋2 min，取出棉布，3 000 r/min 离心5 min，收集上清液，置自动进样瓶中。

空白辅料液：精密移取6.5 mL 帕立骨化醇注射液辅料，置200 mL 容量瓶中，用稀释剂定容，摇匀，精密移取1 mL 置10 mL 容量瓶中，用稀释剂定容，摇匀。

表面干扰溶液：移取1 mL 擦拭剂置15 mL 塑料离心管中，2 根棉签浸湿稀释剂，然后在清洁后的设备表面进行擦拭，取样框范围10 cm×10 cm，在擦拭过程中用棉签蘸少量清洁溶液，首先用1 根棉签横向擦拭，翻转棉签再纵向擦拭；然后用另外1 根棉签沿对角线擦拭，翻转棉签再沿另一方向对角线擦拭，在擦拭时注意棉签一定沿一个方向擦拭，不可来回擦拭。擦拭过程中要求取样框范围内都要擦到，详见图1。擦拭后按样品溶液配制方法提取，即得。

图1 棉签擦拭过程

对照溶液：精密移取帕立骨化醇USP 对照品溶液，用稀释剂稀释成质量浓度为6.5 ng/mL 的溶液，即得。

标准添加溶液：精密移取帕立骨化醇USP 对照品溶液适量，用稀释剂稀释成质量浓度约为0.13 μg/mL的溶液，即得。

样品溶液：用微量注射器分别在3 块清洁过的10 cm×10 cm 不锈钢板均匀滴加标准添加液100 μL，让其自然风干。用2 根预处理过的棉签按棉签擦拭过程擦拭，然后将棉签顶端包裹的棉布剪下，放入上述装有1 mL 擦拭剂的离心管中，加入1 mL 稀释剂，盖紧盖子。超声处理15 min，再涡旋2 min，取出棉布，3 000 r/min离心5 min，收集上清液。

2.3 方法学考察

专性属试验：分别取稀释剂、擦拭剂、空白棉签液、空白辅料液、对照溶液、表面干扰溶液和样品溶液各100 μL 注入液相色谱仪，按拟订色谱条件进样，记录色谱图（见图2），可见，稀释剂、擦拭剂、空白棉签、空白辅料、表面干扰溶液在主峰位置均无干扰。

检测限和定量限测定：取帕立骨化醇对照品适量，并用稀释剂稀释。取信噪比（S/ N）约为3 的溶液作检测限溶液，按拟订色谱条件进样测定，得检测限为0.059 ng。取S/ N约为10 的溶液作定量限溶液并测定，得定量限为0.198 ng。

图2 高效液相色谱图

线性关系考察：精密移取帕立骨化醇USP 对照品溶液，用稀释剂稀释得质量浓度分别为1.98，6.60，13.21，19.81，26.42，33.02 ng/mL 的对照品系列溶液，分别精密量取100 μL，以上述色谱条件测定其峰面积，以溶液的质量浓度（X，ng/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=474.02X-49.72，r=0.999 9（n=6）。结果表明，帕立骨化醇质量浓度在1.98 ～33.02ng/mL 范围内与峰面积线性关系良好。

回收试验：取3 块洁净的10 cm×10 cm 擦拭材料，用微量注射器分别均匀滴加标准添加溶液50，100，150 μL，让其自然风干，每个水平平行制备3 份。然后用2 根预处理过的棉签按棉签擦拭过程擦拭并提取棉签，按上述色谱条件检测，并计算回收率和校正因子。结果见表2。

表2 回收试验结果（n=3）

精密度试验：取100 μL 对照溶液，按色谱条件分别在同一时间重复进样6 次，考察日内精密度，连续3 d重复进样6 次，考察日间精密度，并记录峰面积。结果RSD均小于2.0% （n=6），表明仪器精密度良好，详见表3。

表3 仪器精密度试验结果（ n=6）

重复性试验：依法制备并测定6 份100%准确度水平样品。结果各样品的取样回收率均在87.6% ～93.5%之间，RSD为2.9%，表明方法重复性良好。

重现性试验：由另外一名试验员在不同日期，使用不同的液相系统和不同的色谱柱，按100%准确度水平样品的制备方法制备6 份不锈钢样品溶液，并与重复性结果进行比较。经计算，样品取样回收率均在105.5% ～125.7%之间，RSD均不超过7.0%，2 名试验员差值为16.5%，表明方法重现性良好。

稳定性试验：将对照品和样品溶液储存于5 ℃条件下，并分别于0，1，2，3，5，7 d 测定。经计算，与0 d 回收率的差值均不超过10.0%，表明对照品溶液和样品溶液在5 ℃条件下存储7 d 稳定。

2.4 残留量检测

采用该清洁分析方法对我厂车间生产帕立骨化醇注射液后并完成清洁的设备进行擦拭取样，共评估27个点，编号为SC1-SC27，其中SC26 的检测结果为0.08 ng/cm2，其他点均未检测出残留。

3 讨论

目前车间生产的产品为共线生产，存在产品间的交叉污染风险。控制交叉污染的有效措施之一就是对产品进行清洁验证，目的是证明所有与产品接触的设备所使用的清洗程序能有效地除去产品残留，达到预先确定的限度，从而达到对下批产品无影响的目的。目前计算残留限度的方法为1/1 000 日剂量，半数致死量（LD50）和10 ×10-6。上述判定是根据基于风险防止药品生产中交叉污染及“共用设施中不同药品生产风险识别所用基于健康的暴露限设定指南”实施问题的征求意见稿[9]。2018 年4 月，该指南最终稿发布，第4 季度做出相应的修订，所有产品的清洁限度均需用每日允许暴露量（PDE）进行计算，应根据所涉及物料，合理确认产品残留。故本研究的最大允许残留限度分别采用了10×10-6、最低日治疗剂量、LD50和PDE 4 种方式进行计算，限度分别为1.58，0.13，0.15，0.16 ng/cm2。可见基于最低日治疗剂量，帕立骨化醇注射液的最大允许残留限度最低，风险最大，因此采用该限度作为限度水平。试验过程中取样面积为100 cm2，故标准溶液浓度为6.5 ng/mL（100 cm2×0.13 ng/cm2÷2 mL=6.5 ng/mL）。2 mL 为样品总体积，包括1 mL 的擦拭剂及1 mL 稀释剂。

清洁分析方法开发过程中，关键点分别为样品的擦拭提取和分析方法的专属性、灵敏度和可重复性。经多次试验最终选取了50%乙醇作为擦拭溶剂[10-11]和稀释溶剂。为消除空白棉签的干扰，将方法设置为梯度洗脱，为增加灵敏度，降低了样品的稀释倍数，增加了样品的进样量，同时需要保证良好的峰形。由于在清洁擦拭取样过程中，人员操作非常关键，为保证方法的可重复性及重现性[12]，文中进行相应考察，结果良好。

由于在生产过程中物料会与不同材质的生产设备相互接触，不同的材质对帕立骨化醇的吸附能力存在差异，采用相同的擦拭回收方法，可能会出现取样回收结果不一致的情况，故对不同材质均进行了回收率研究[13]，包括不锈钢、钢化玻璃、有机玻璃和聚四氟乙烯。结果4 种材质所得结果均符合标准，但不同材质间的回收率有明显差异。

因为制药设备清洁验证过程中，样品并不能一起送至实验室，有时间隔会很长，为了节约时间和成本，需要尽量将样品一起检测，所以稳定性研究非常必要。不同药品的稳定性存在很大差异，美国注射药物协会建议：在进行溶液稳定性研究时，如果药品不具备良好的稳定性，可在低温下进行研究；如果药品非常不稳定，那么应同时考察残留的药品降解产物，避免残留的降解产物对其他产品造成污染。

综上所述，该方法灵敏度、准确性、重复性和稳定性均良好，适用于帕立骨化醇注射液清洁残留样品的检测。在清洁验证取样时，应采用50%乙醇作为擦拭溶剂，为降低风险，最后结果应用最大校正因子值1.6 进行校正[14]，以有效控制交叉污染。