枫香脂挥发油抑菌性试验

覃 晓，李 炎△，王 玲，饶伟文，向梵

（1. 广西壮族自治区桂林市食品药品检验所，广西 桂林 541012； 2. 广西中医药大学，广西 南宁 530000）

枫香脂为金缕梅科枫香属植物枫香树Liquidambar formosanaHance 的干燥树脂，作为传统中药，收载于2015 年版《中国药典（一部）》[1]，有活血止痛、解毒生肌功效，用于治疗跌打损伤、痈疽肿痛、内外出血等。枫香脂含有树脂和挥发油两大类成分，其中树脂部分含五环三萜类酸及酯类化合物，如齐墩果酮酸、羽扇豆酮酸、齐墩果酮醇，肉桂酸肉桂酯、肉桂酸肉桂醇等；挥发油部分含石竹烯、蒎烯、莰烯、松油烯、乙酸龙脑酯等数10 种化合物[2-6]。动物实验表明，枫香脂中挥发油有提高心肌耐缺氧能力、降低小鼠室颤发生率、提高冠脉流量、舒张血管、抑制血栓形成等[7-10]，以及抗肿瘤等作用[11-14]。此外，从枫香叶提取的挥发油还有明显的抑菌作用，用于枇杷、砂糖橘、圣女果的防腐保鲜也有较好的效果[15-17]。枫香树在我国分布广泛，资源丰富。枫香脂中的挥发油常温放置分层为两部分：上层液体部分为枫香精油，下层半固体部分为枫香重油。为了进一步开发枫香树的利用价值，本研究中将这两部分分别进行抑菌性试验。现报道如下。

1 材料

1.1 仪器

BD240 型微生物培养箱，KB240 型生化培养箱，均购自德国Binder 公司；AC2-4S1 型生物安全柜（新加坡Esco 公司）；Sup G6R 型菌落计数/筛选/抑菌圈测量联用仪（杭州迅数科技有限公司）。

1.2 试药

挥发油样品（以液态枫香树脂通过蒸馏法提取得到，收率为16% ），原植物经检验所饶伟文主任药师鉴定为正品。庆大霉素标准品（批号为130326-201716，含量每1 mg 相当于637 U），环吡酮胺对照品（批号为100232-201402，含量99.8%），均购自中国食品药品检定研究院。胰酪胨大豆蛋白琼脂培养基（TSA，批号为180820），胰酪胨大豆蛋白液体培养基（TSB，批号为170722），沙 氏 葡 萄 糖 琼 脂 培 养 基（SDA，批 号 为181127），沙 氏 葡 萄 糖 液 体 培 养 基（SDB，批 号 为180411），均购于北京陆桥技术有限责任公司。丙酮为分析纯，95%乙醇、聚山梨酯80 为化学纯。

1.3 菌株

大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、短小芽孢杆菌[CMCC（B）63202]、黑曲霉菌[CMCC（F）98003]，均购自中国食品药品检定研究院；白色念珠菌[CMCC（F）98001，购自原南宁食品药品检验所]；表皮葡萄球菌[CMCC（B）29069]，福氏志贺氏菌（ATCC12022），均购自桂林朝仪商贸有限公司；蜡样芽孢杆菌[CMCC（B）63303]、产气肠杆菌（ATCC13048）、鼠伤寒沙门氏菌（ATCC14028）、酿酒酵母（ATCC9763），均购自原广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心；黄曲霉菌（CICC2219）购自原中国工业微生物菌种管理中心。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 溶液制备

菌悬液：取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、短小芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、福氏志贺氏菌、蜡样芽孢杆菌、产气肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌甘油冷冻管，接种在TSB 培养基中，36 ℃条件下培养24 h，采用平板计数法，将菌液制成浓度为107～108的菌悬液，冰箱中保存，备用。取白色念珠菌、酿酒酵母菌甘油冷冻管，接种到SDB 液体培养基，28 ℃条件下培养48 h，同细菌计数法制成浓度为107～108的菌悬液，冰箱中保存，备用。取黑曲霉、黄曲霉的新鲜培养物，接种至SDA 斜面培养基，25 ℃条件下培养7 ～8 d，加入5 mL 含0.05% 聚山梨酯80的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱，用无菌吸管吸出孢子液。可根据用量多制备几个斜面。同上述方法制备成浓度为105～106的菌悬液，冰箱中保存，备用。

供试品溶液：取样品（半固体约50 ℃熔化）原液，作100%供试品溶液；取样品（半固体约50 ℃熔化）50 mL，加丙酮至100 mL，摇匀，作50%供试品溶液。

对照溶液：取庆大霉素标准品10 mg，精密称定，根据对菌株的抑菌效力强弱加灭菌水制成10，20，100 U/mL 3 种浓度的细菌对照溶液。取环吡酮胺对照品10 mg，精密称定，加乙醇制成质量浓度为0.4 mg/mL 的真菌对照溶液。

空白溶液：以100%丙酮作为空白溶液。

2.1.2 样品抑菌性测定采用纸片法[16]。在安全柜里将完成灭菌的培养基倾注15 mL 于平皿中（细菌用TSA 培养基，霉菌用SDA培养基），待其凝固，在上面平铺含5%细菌的TSA 培养基（或含4%霉菌、5%酵母菌的SDA 培养基）5 mL，制成带菌平板；贴上浸泡约10 min 供试品溶液的纸片，同时用浸泡庆大霉素标准品溶液的纸片作细菌抑菌性对照，用浸泡环吡酮胺对照溶液的纸片作霉菌、酵母菌抑菌性对照，用浸泡丙酮溶液的纸片作空白对照。每个板贴4 片，其中样品成对角贴2 片，对照与空白成对角各1 片，平行3 份。细菌置36 ℃条件下培养24 h，真菌置28 ℃条件下培养48 h，测量抑菌圈直径，重复2 次，结果取平均值，详见表1。抑菌效果见图1。样品的抑菌活性与对照溶液抑菌活性进行比较，又形成倍比关系，详见表2。

2.1.3 最低抑菌浓度测定

称取样品，加灭菌的10%聚山梨酯80，混匀，用灭菌好的TSB 培养基（真菌用SDB 培养基）稀释成20%的供试品溶液。采用等比稀释法进一步稀释成20%，10%，5%，2.5%，1.25%，0.625%，0.312%，0.156%系列体积分数。分别吸取10mL分装试管，分别加1 种菌悬液各50 μL，摇匀。同时取相同稀释剂，加适量聚山梨酯80，摇匀，分别作阴性和阳性（阳性管加菌悬液50 μL）对照。细菌36 ℃条件下培养24 h，真菌置28 ℃条件下培养48 h。吸取1 mL 培养好的样品溶液注皿（每皿0.5 mL），倾注培养基摇匀待其凝固；同时从样品溶液中取一环划平板做同步试验，细菌用TSA 培养基、真菌用SDA 培养基，细菌36 ℃条件下培养24 h，真菌28 ℃条件下培养48 h。重复3 次。观察平板，找出未长菌的最低浓度，即为最低抑菌浓度。详见表3。

图1 样品抑菌效果图

表1 各溶液抑菌性比较（抑菌圈直径，mm）

表2 50%供试品溶液抑菌活性倍数与对照溶液浓度比较

表3 样品对各菌株的最低抑菌浓度（枫香重油/精油）

2.2 结果与分析

通过贴纸片法和最低抑菌浓度试验，枫香重油、枫香精油两个供试品溶液对受试的14 种菌株均有不同程度抑制，两者试验结果一致。从表1 及表3 可知抑菌强度：革兰阳性菌＞革兰阴性菌，真菌类＞细菌类，芽孢类杆菌＞其他细菌，供试品溶液浓度与其抑菌活性呈量比关系，但不明显，可能与油和有机溶剂的扩散性有关。表2 中通过比较供试品溶液与对照品溶液抑菌活性，可直观看出供试品溶液对每个菌株的抑菌活性强度。

3 讨论

通过两样品不同菌株的抑菌试验证明，枫香脂中挥发油室温下分层的两部分对试验菌株的抑制作用差异不大，两者对细菌类最低抑制浓度可达5%，对芽孢类杆菌甚至可达1.25% ，对霉菌最低抑制浓度可达1.25%，对酵母类最低抑制浓度可达0.625%。

从以往的文献资料中可知，枫香脂精油对心血管及抗肿瘤方面都有较好的生物活性[7-14]。本研究结果表明，枫香脂精油对金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、大肠埃希菌、产气肠杆菌、白色念珠菌、黄曲霉菌、酿酒酵母等14 个菌株均有较强的抑制作用，其作用强度优于枫香叶挥发油[15-18]。枫香树在我国资源丰富，新鲜枫香树脂中挥发油含量高达15% ～20%，目前主要用作香精的原料，应用范围相对较窄。因此，继续深入研究枫香脂挥发油在医疗、化工、食品行业上的应用前景广阔。

预试验中比较了乳化溶液贴纸片法、生物检定（管碟）法[18-19]、表层涂布菌液培养基打孔法[20]、表层菌液涂布贴纸片法[21]，结果均有不稳定性因素影响抑菌圈的圆整性、均匀性，甚至无法产生抑菌圈，表明供试品溶液制备和试验方法对抑菌性试验结果影响较大。经综合考虑各种影响因素，采用试剂溶解、加厚菌层、对照比对贴纸片法。每次的试液量相对恒定，菌层生长均匀，容易得到大小均一、圆整透明的抑菌圈；四角对贴又可与对照、空白比较，一目了然。但要注意，抑菌圈直径的大小受菌液浓度影响，菌悬液的浓度在使用过程中就是一个量变过程，所以菌液浓度应控制在107左右，每次试验菌层浓度应相同，且重复性试验尽量短时连续做。

最低抑菌浓度检测直接将样品加乳化剂制成乳液，采用试管等比稀释，并用培养基稀释法测定。此方法操作简单，无有机溶液干扰，且重复性好。

综上所述，该方法操作简便，较稳定。枫香脂中挥发油具有较强和较广泛的抑菌作用，值得进一步研究开发利用。