传统风干牦牛肉加工过程中肌原纤维蛋白氧化对氨基酸的影响

郭兆斌，马纪兵，张丽，陈骋，陈立业，刘勇，韩玲*，余群力

1(甘肃农业大学 食品科学与工程学院，甘肃 兰州，730070)2(兰州中检科测试技术有限公司，甘肃 兰州，730070) 3(甘肃农业工程咨询设计所有限公司，甘肃 兰州，730070)

牦牛是世界上生活在海拔最高处的哺乳动物，主要分布在喜马拉雅山脉和青藏高原等海拔3 000 m以上的高寒地区[1]。中国牦牛占世界总数的90%，其中多数生长在西藏高原[2-3]。风干牦牛肉是通过青藏高原地区冬季低温低气压的天然气候条件，将牦牛肉分割成条形后进行自然风干所制成的一种富有民族特色的储藏性高的牦牛肉制品[4-5]。

肉制品在加工、贮藏、运输过程中极易发生氧化。氧化可分为脂质氧化和蛋白氧化，两者都具有相似的氧化过程。过度的蛋白氧化会影响蛋白质的理化性质，从而破坏氨基酸，对肉制品的加工特性和营养价值有不利影响；而脂肪氧化最终产生小分子的醛、酮等有机化合物会影响肉制品的风味，产生不愉快气味，抑制脂肪氧化在一定程度上可以抑制蛋白氧化[6]。牦牛肉及肉制品中含有一些氧化剂成分以及较高的不饱和脂肪酸，因而会使肌原纤维蛋白在生产加工过程中极易发生氧化[7]。李银等[8]通过研究在—OH氧化模型下，H2O2浓度对于肌原纤维蛋白中的敏感氨基酸的氧化效应，这为进一步揭示肌原纤维蛋白氧化对氨基酸的影响提供了有力依据。有相关研究表明,牦牛肉在风干加工中部分氨基酸含量会降低，高媛等[9]在研究中表明牦牛肉在风干和后续加工过程中部分氨基酸含量会降低，而这些变化都与肌原纤维蛋白的氧化作用密切相关，但是对于肌原纤维蛋白氧化对氨基酸影响效果的研究目前鲜有报道。

本试验采用甘肃省甘南州公牦牛半膜肌为研究对象，分别在风干加工过程中的0、2、4、6、8、10、20、30、40 d测定其半膜肌中羰基含量、巯基含量、二酪氨酸含量以及过氧化值(peroxide value,POV)和硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid value，TBA)，并分析传统风干牦牛肉在加工过程中蛋白氧化和脂肪氧化对氨基酸的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验样品：甘肃甘南公牦牛半膜肌约10 kg。

试剂：三羟甲醛氨基甲烷、KCl、K2HPO4、MgCl2、2,4-二硝基苯肼、乙二醇二乙醚二胺四乙酸，5,5′-二硫带双(2-硝基苯甲酸)、叠氮钠、异硫氰酸胍、溴酚蓝、尿素、KH2PO4、NaH2PO4、三氯乙酸、HCl、H2SO4、钼酸铵、FeSO4(分析纯)，天津市致远化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SP-756P紫外可见分光光度计，上海市美谱达仪器有限公司；L-8800型氨基酸自动分析仪，日本日立公司；HH-2型电热恒温水浴锅，西安省科昊生物工程有限责任公司；FSH-2A可调高速匀浆机，江苏金坛友联仪器研究所；TGL-16MC台式高速冷冻离心机，湖南省湘仪集团；970CRT荧光分光光度计，天美科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 肌原纤维蛋白的提取

根据PARK等[10]的研究方法稍作修改，称取1 g肉样，加10倍体积标准盐溶液(20 mmol/L磷酸钾缓冲液，0.1 mol/L KCl，2 mmol/L EGTA，2 mmol/L MgCl2，pH 6.8)均质，4 ℃条件下离心10 min(1 000×g)，弃去上清，沉淀用8倍体积标准盐溶液溶解后，4 ℃离心10 min(1 000×g)弃上清，重复2次。沉淀用8倍体积100 mmol/L KCl溶液溶解后，4 ℃离心10 min(1 000×g)弃上清，重复2次。采用双缩脲法定量蛋白。

1.3.2 羰基含量的测定

参考OLIVE等[11]的研究方法并做修改，在2.0 mL的离心管中，加入0.1 mL的蛋白溶液与0.5 mL 2,4-二硝基苯肼的HCl溶液，25 ℃下反应40 min，空白样品中不加2,4-二硝基苯肼。然后加入0.5 mL 20%的三氯乙酸，振荡后离心(11 000×g，5 min)弃上清，沉淀用1 mL乙醇-乙酸乙酯溶液(体积比1∶1)洗涤3次，待溶剂挥发完后将蛋白质悬浮于1 mL 6 mol/L盐酸胍溶液中， 37 ℃条件下水浴保温30 min。以空白溶液为对照，370 nm下测其吸光值，蛋白质羰基衍生物的含量(nmol/mg蛋白)用摩尔吸光系数22 000 L/(mol·cm)进行计算。

1.3.3 巯基含量的测定

参考LIU等[12]的试验方法测定巯基含量，取0.5 mL、2 mg/mL蛋白液(分散在25 mmol/L磷酸盐缓冲液中，pH 6.25)中，依次加入2 mL尿素-SDS溶液(含8.0 mol/L尿素，30 g/L SDS，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.4)和0.5 mL 10 mmol/L DTNB试剂(溶解在0.1 mol/L磷酸钠缓冲液中，pH 7.4)，在室温下反应15 min后于412 nm处读数。0.5 mL 25 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.25)代替蛋白液用于空白对照。摩尔消光系数为13 600 L/(mol·cm)。

1.3.4 二酪氨酸含量的测定

参考MALENCIK等[13]研究的方法测定二酪氨酸含量，将含有10 mg肌原纤维蛋白的悬浮液溶于3 mL高离子强度缓冲液(0.6 mol/L KCl，pH 6.0，20 mmol/L磷酸缓冲液)中，滤纸过滤除去残留脂肪和不溶性物质。双缩脲法测定滤液蛋白含量。荧光光度法测定滤液中二酪氨酸含量，测定条件为：发射波长420 nm(狭缝5 nm)，激发波长325 nm(狭缝5 nm)。测定结果用荧光强度除以蛋白浓度，表示为相对荧光值。

1.3.5 过氧化值(POV)的测定

参考GB5009.227—2016中过氧化值的测定方法，称取2～5 g风干肉样品置于250 mL碘量瓶中，加入50 mL乙酸-异辛烷溶液，匀浆混匀试样。加入0.5 mL饱和KI溶液，盖上盖子摇动1 min，然后在暗处放置3 min左右，取出加入30 mL蒸馏水后立即加入0.5 mL淀粉溶液，滴定至蓝色消失，即为终点。同时进行空白试验。用过氧化物的毫克当量数表示时，结果根据公式(1)计算:

(1)

式中：X，过氧化值，g/100 g；V，试样滴定消耗硫代硫酸钠溶液的体积,mL；V0,空白滴定消耗硫代硫酸钠溶液的体积,mL；C,硫代硫酸钠标准滴定溶液的浓度,mol/L；m,试样的质量g；1 000,换算系数。

1.3.6 硫代巴比妥酸值(TBA)的测定

使用JUNCHER等[14]的方法，准确称取样品5.00 g，与25 mL质量分数20%(含质量分数 0.1% EDTA)三氯乙酸溶液和20 mL冷冻去离子水混合，均质60 s，并在25 ℃的室温下静置20 min。然后将混合物离心10 min(6 000×g)，并用去离子水将上清液稀释至50 mL。最后，取稀释的上清液5 mL与0.02 mol/L 2-硫代巴比妥酸5 mL混合，并在95 ℃的水浴中保持20 min。通过流动的水将反应溶液冷却至室温后，在532 nm下测量吸光度并用去离子水作为空白对照。计算TBA如公式(2)：

TBA=A532×7.8

(2)

式中：A532，通过1.0 cm比色皿在532 nm处的吸光度。

1.3.7 氨基酸分析

参考国家标准《食品中氨基酸的测定》(GB5009.124—2016)。

1.4 数据统计分析

试验结果均采用平均值±标准差表示，数据均平行测定3次，用SPSS 22.0软件进行方差分析，用Origin 2018软件制图。

2 结果与分析

2.1 羰基含量变化

图1为风干牦牛肉加工过程中羰基含量变化，羰基是蛋白发生氧化的标志性产物。由图1可知，羰基化合物含量随风干时间的延长呈逐渐上升的趋势。原料肉中羰基含量为2.63 nmol/mg，风干到40 d时达到8.16 nmol/mg，羰基含量增加了5.53 nmol/mg，风干30 d时含量显著低于风干40 d时羰基含量(P<0.05)，0～30 d含量显著低于40 d(P<0.05)。羰基是氨基酸发生氧化后的产物，它的产物的形成主要来自赖氨酸、脯氨酸、精氨酸等的直接氧化，并且其含量可作为评价蛋白质发生氧化程度的重要指标之一[15]。肌肉蛋白的氧化是一种具有非酶促的不可逆的蛋白化学修饰作用，这种修饰作用涉及到羰基基团的形成，羰基基团是在氧应激作用下所形成的一种基团[16]。羰基化合物的生成说明肌原纤维蛋白氧化程度的加剧，即羰基含量越高，肌原纤维蛋白氧化越剧烈[17]。

图1 风干牦牛肉加工过程中羰基含量变化Fig.1 Changes of carbonyl content in air-dried yakmeat processing注：图中不同小写表示差异显著。下同。

2.2 巯基含量变化

肌原纤维蛋白巯基易被氧化而产生损失，巯基含量将会越低，氧化作用的程度越高。牦牛肉在自然冷冻风干过程中的巯基含量变化如图2所示。由图2可知，随着风干时间的延长，巯基含量呈现出下降的趋势，牦牛原料肉中巯基含量为71.03 nmol/mg，当风干到40 d时达到30.15 nmol/mg，含量降低了40.88 nmol/mg，风干20 d时巯基含量显著高于(P<0.05)40 d时巯基含量，0～20 d极显著高于(P<0.01)40 d 时的巯基含量。肌原纤维蛋白中有大量的自由巯基，尤其在肌球蛋白中，每一个肌球蛋白大约含有40个巯基，由于牦牛肉风干加工过程中肌原纤维蛋白的空间结构可能发生了一定的改变，从而导致分子内部的巯基暴露被氧化为二硫键，因此巯基含量降低[18]。故巯基含量的降低极有可能是因为肌原纤维蛋白中形成了多肽分子之间或内部的二硫键，进而导致蛋白结构表面的巯基含量下降[19]。因此巯基含量的下降表明肌原纤维蛋白氧化加快，巯基含量越低，肌原纤维蛋白氧化程度越高[20]。

图2 风干牦牛肉加工过程中巯基含量变化Fig.2 Changes of sulfhydryl group content inair-dried yak meat processing

2.3 二酪氨酸含量的变化

二酪氨酸含量可用相对荧光值(A.U.)来表示。风干牦牛肉加工过程中二酪氨酸含量变化情况如图3所示。由图3可知，随冷冻风干加工过程中时间的延长，二酪氨酸含量的A.U.值呈上升趋势，在风干加工0 d时，其A.U.值为28.9，至40 d时达到49.1，增加了20.2。在整个风干加工过程0～40 d，二酪氨酸相对荧光值(A.U.)变化显著(P<0.05)。酪氨酸是容易受活性氧自由基攻击的敏感性氨基酸之一，而二酪氨酸是在其氧化之后的产物，故二酪氨酸的含量也可作为衡量蛋白质发生氧化程度的重要指标之一，即二酪氨酸含量越高，肌原纤维蛋白氧化程度越高[21]。

图3 风干牦牛肉加工过程中二酪氨酸含量变化Fig.3 Changes of dityrosine content in air-driedyak meat processing

2.4 POV值的变化

POV值反映脂质发生一级氧化的程度，主要是脂肪降解产生的不饱和脂肪酸中的双键与环境中的氧气发生氧化反应形成的一种中间氧化产物[22]。风干牦牛肉加工过程中POV值变化情况如图4所示，由图4可知，随风干加工时间的延长，POV值呈上升趋势，在风干0 d时，其值为1.16 mmol/kg，至40 d时达到1.85 mmol/kg，增加了0.69 mmol/kg。在风干0～6 d，POV值变化显著(P<0.05)且呈上升趋势；在6～10 d变化不显著，且6～10 d的POV值显著低于20～40 d的(P<0.05)POV值。整个风干过程POV值呈上升趋势，过氧化值显著增加，说明氢过氧化物的生成速率大于脂肪酸的生成速率，脂肪氧化程度进一步加深。但是风干的各阶段差异显著，原因可能是牦牛肉风干成熟期间积累氢过氧化物，随着风干时间生成醛、酸、酮等物质导致过氧化物的增多或者减少。

图4 风干牦牛肉加工过程中POV值的变化Fig.4 Changes of POV content in air-dried yakmeat processing

2.5 TBA值的变化

TBA反映脂肪发生二级氧化的程度。风干牦牛肉加工过程中TBA值变化情况如图5所示。由图5可知，随风干时间的延长，TBA值呈上升趋势，在风干0 d时，其值为0.20 mg/kg，至40 d时达到0.69 mg/kg，增加了0.49 mmol/kg。风干前期(0～8 d)变化不显著，第8天值为0.29 mg/kg，仅比0 d时高出0.09 mg/kg；风干后期(8～40 d)TBA值呈显著上升趋势(P<0.05)，40 d的值比8 d时高出0.40 mg/kg。风干肉中脂类物质在贮藏期会水解生成游离脂肪酸，在脂肪氧化酶的作用下氧化为氢过氧化物，然后进一步分解为醛、酮等小分子终产物，此过程其主要产物为丙二醛，结果表明随着风干时间的延长，能促进丙二醛等次级氧化产物的生成，进而导致肌原纤维蛋白的氧化[23]。木卡代斯·木合旦尔等[24]发现羊火腿风干成熟期间丙二醛含量先快速上升后缓慢上升、羰基含量也呈先急剧上升后缓慢上升的趋势，与本文风干牦牛肉得出的结论相似。风干初期差异不显著的原因可能是不稳定的丙二醛被降解成挥发性化合物或与蛋白质的游离氨基酸进行反应。

图5 风干牦牛肉加工过程中TBA值的变化Fig.5 Changes of TBA content in air-driedyak meat processing

2.6 氨基酸分析

由表1可知，风干牦牛肉共检测出水解性氨基酸17种，大多数氨基酸的含量均随肌原纤维蛋白氧化加剧而呈现轻微下降趋势，氨基酸总量也随之下降，风干牦牛肉中的氨基酸总量为38.86 g/100 g，原料肉为42.12 g/100 g，即风干牦牛肉氨基酸含量比原料肉低3.26 g/100 g，缬氨酸、苏氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸及丝氨酸对氧化作用不敏感，氧化前后其含量变化不显著。而半胱氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸及苯丙氨酸对氧化作用敏感，随氧化时间延长，6种敏感氨基酸呈显著下降趋势，当氧化时间达到40 d时，半胱氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸及苯丙氨酸的含量分别下降了51.2%、33.1%、18.9%、16.3%、47.9%和0.05%。异亮氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸是风干牦牛肉中的主要鲜味氨基酸，它们的总量为18.99 g/100 g，这6种氨基酸是形成肉品香味物质所必需的前体氨基酸，它们与形成肉制品的风味有密切的关系，6种氨基酸中谷氨酸的含量是最高的，为6.58 g/100 g，约占鲜味氨基酸总量的34.65%，具有形成肉鲜味的作用和缓冲酸与咸等味道的特殊功能。风干牦牛肉中的组氨酸含量为1.30 g/100 g，而原料肉中的含量是1.27 g/100 g，即表示风干牦牛肉组氨酸含量比原料肉高出0.03 g/100 g，组氨酸是尿毒症患者的必需氨基酸，对婴幼儿来说也是必需氨基酸，同时，组氨酸会在脱羧之后形成组胺，具有很强的舒张血管的效果[25]。

牦牛肉在风干加工过程中，随着风干时间的延长，羰基含量的上升，巯基含量的下降以及二酪氨酸含量的升高均表明肌原纤维蛋白发生了一定程度上的氧化，而蛋白发生氧化通常引起的变化是氨基酸的破坏，肽链的伸展断裂以及蛋白交联，从而导致肌原纤维蛋白功能性及理化性质的改变[26]。虽然氨基酸侧链容易遭受自由基与非自由基攻击，并且氨基酸侧链氧化会形成羰基化合物，但是不同的氨基酸对自由基有不同的灵敏性，比如苏氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、亮氨酸及谷氨酸等氨基酸残基通常会成为经脂氧化产生的自由基攻击的目标[27]。这正好说明了这几种氨基酸对氧化作用的敏感性更强。所以蛋白氧化会降低总氨基酸及必需氨基酸含量，同时，几乎绝大多数氨基酸的含量都有不同程度的下降[28]。本试验研究表明，半胱氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸及苯丙氨酸对氧化作用非常敏感，缬氨酸、苏氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸及丝氨酸对氧化作用不敏感，氧化前后其含量变化不显著。

表1 风干牦牛肉加工过程中氨基酸含量变化Table 1 Changes of amino acid content in air-dried yak meat processing

注：表中不同小写字母表示差异显著。

2.7 各氧化指标与氨基酸相关性分析

由表2可知，酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸含量与羰基、二酪氨酸、POV值、TBA值均呈极显著负相关(P<0.01)，与巯基含量呈极显著正相关(P<0.01)；异亮氨酸含量与POV值及TBA值呈极显著负相关(P<0.01)，与羰基及二酪氨酸含量呈显著负相关(P<0.05)，与巯基含量呈极显著正相关(P<0.01)；蛋氨酸与羰基及二酪氨酸含量均呈正相关，与巯基含量、POV值、TBA值呈负相关，不具有显著性差异；半胱氨酸含量与POV值及TBA值呈极显著负相关(P<0.01)，与羰基、二酪氨酸、巯基含量不具有显著性差异；POV值、TBA值与羰基及二酪氨酸含量呈极显著正相关(P<0.01)，与巯基含量呈极显著负相关(P<0.01)。综上所述，风干肉加工过程中肌原纤维蛋白氧化主要是由于脂肪氧化所引起的，亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸对2种氧化作用最为敏感。

表2 各氧化指标与氨基酸相关性分析Table 2 Correlation analysis of oxidation indexes and amino acids

注：“*”表示相关性显著(P<0.05);“**”表示相关性极显著(P<0.01)。

3 结论

风干牦牛肉在加工过程中，肌原纤维蛋白中羰基和二酪氨酸的含量显著增加，巯基含量显著降低；POV值和TBA值均呈现不断上升的趋势，表明风干牦牛肉肌原纤维蛋白在风干过程中蛋白氧化加剧。随着肌原纤维蛋白氧化和脂肪氧化加剧，风干牦牛肉中必需氨基酸含量均低于原料肉，风干牦牛肉非必需氨基酸中组氨酸、精氨酸、脯氨酸、谷氨酸及甘氨酸含量均高于原料肉。酪氨酸、亮氨酸及苯丙氨酸对氧化作用非常敏感；缬氨酸、苏氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸及丝氨酸对氧化作用不敏感，氧化前后其含量变化不显著。